李同方，刘 霞，孙雪婧，杜晓华

(1 甘肃农业大学 a 动物医学院，b 生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃 兰州 730070)

脑红蛋白在成年牦牛脑中的表达研究

李同方1a,2，刘 霞1b,2，孙雪婧1a,2，杜晓华1a,2

(1 甘肃农业大学 a 动物医学院，b 生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃 兰州 730070)

【目的】 探寻脑红蛋白(Neuroglobin，NGB)在成年牦牛脑不同部位中的分布特征。【方法】 选择健康成年牦牛8只，宰杀后取其大脑皮质、小脑皮质、海马、延髓、纹状体及嗅球等部位的脑组织，利用免疫组织化学染色SP法和实时荧光定量PCR技术，对NGB在成年牦牛脑不同部位中的分布特征及定量关系进行观察与检测。【结果】 NGB在成年牦牛脑不同区域的表达强弱有明显差异，在大脑皮质中NGB基因的相对表达量(262.69±9.19)极显著高于小脑皮质(137.00±7.29)、海马(1.00±0.22)、延髓(3.43±0.76)、纹状体(7.65±0.61)及嗅球(2.14±1.22)。【结论】 NGB在成年牦牛脑不同部位中高表达，提示NGB在脑组织的氧利用及功能活动中发挥着重要作用。

脑红蛋白；免疫组织化学；实时荧光定量PCR；牦牛

2000年，德国科学家Burmester等[1]在Nature上首次报道，在人和小鼠脑内存在一类新的、主要分布于中枢神经系统的特异性携氧球蛋白，称为脑红蛋白(Neuroglobin，NGB)。NGB的发现为脑缺氧的研究提供了新的思路。近年来，NGB已逐渐成为国内外学者研究的热点[2-5]，但有关NGB作用的生理机制仍不明确。牦牛是分布于青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区的牛种之一，对高寒低氧环境具有较强的适应性。由于NGB能够可逆性地与氧结合，并且与氧的亲和力很高，所以当血氧浓度较低时，NGB在转运氧通过血脑屏障，提高脑组织氧的利用率方面发挥着重要作用[1]。目前，国内外对NGB组织分布的研究主要集中在人和啮齿类动物[6-8]上，对于NGB在牦牛脑不同部位分布特征的研究尚未见报道。本试验利用免疫组织化学染色SP法和实时荧光定量RT-PCR技术，对NGB在成年牦牛脑不同部位组织细胞中的分布特征及定量关系进行了观察与检测，以期为进一步研究NGB在脑组织中的生理功能提供重要的形态学资料，为探讨牦牛高原适应性机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

从甘肃省甘南藏族自治州合作市屠宰厂采集8只健康成年牦牛(170～200 kg，雌雄各4只)的大脑皮质、小脑皮质、海马、延髓、纹状体和嗅球组织，迅速投入液氮和福尔马林保存液中保存备用。

兔抗鼠NGB多克隆抗体(bs-1859R)，购自博奥森生物技术有限公司(北京)；免疫组织化学染色试剂盒(sp-9001)及DAB显色试剂盒(ZLI-9018)，购自中杉金桥生物技术有限公司(北京)。RNA提取试剂盒，购自生工生物公司(上海)；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒，购自宝生物工程有限公司(大连)；RNase-Free ddH2O，购自天根生化科技有限公司(北京)。

1.2 NGB在牦牛脑中表达的免疫组化SP法检测

1.2.1 组织切片制备 牦牛宰杀后，迅速取大脑皮质、小脑皮质、海马、延髓、纹状体、嗅球组织，置于体积分数4%的甲醛固定液中固定，18 h后，流水冲洗12 h，常规脱水、石蜡包埋，制作石蜡切片。

1.2.2 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SP法进行染色，步骤如下：石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精水化，PBS(0.01 mol/L，pH=7.2，下文同) 冲洗3次，每次5 min；高压条件下抗原修复2 min，室温冷却，PBS冲洗2次，每次3 min；体积分数3% H2O2水溶液封闭10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；体积分数10%正常羊血清清蛋白孵育15 min后，倾去勿洗；每张片子滴加50 μL 1∶500倍稀释的兔抗鼠NGB多克隆抗体，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3次，除去PBS，每张切片滴加50 μL 1∶500倍稀释的生物素标记山羊抗兔IgG工作液，37 ℃孵育15 min后，PBS冲洗3次，每次5 min；每张切片滴加50 μL辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min后，PBS冲洗3次，每次5 min；除去PBS，滴加新鲜配制的DAB显色液，在显微镜下观察并控制显色；蒸馏水终止反应，苏木精复染、脱水透明、中性树胶封固。试验同时设阴性对照组(以PBS替代一抗进行染色)。

1.3 NGB在牦牛脑中表达的荧光定量检测

1.3.1 牦牛组织总RNA提取与反转录 用RNA提取试剂盒对大脑皮质、小脑皮质、海马、延髓、纹状体、嗅球组织总RNA进行提取，用紫外分光光度计检测提取的RNA质量。按照反转录试剂盒说明书去除基因组中残留的DNA后反转录为cDNA，-70 ℃保存备用。

1.3.2 引物设计与合成 根据GenBank中牦牛NGB基因及β-actin基因序列进行引物设计，用Primer 3.0在线软件设计特异性引物。引物序列及片段大小如表1所示。

用NCBI中的Primer-BLAST程序检测引物本身不形成发夹结构，两引物间不形成二聚体。扩增引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.3.3 Real-time PCR反应 采用SYGB染料法检测目的基因的相对表达量。在实时荧光定量仪MX3005P中进行扩增反应。反应条件控制如下：95 ℃ 预变性 10 min；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，重复40个循环;4 ℃保存。每种样品重复3次，结果取平均值。反应结束后，由电脑自动得出荧光定量曲线。

1.3.4NGB在成年牦牛脑不同部位的表达检测 NGB在成年牦牛脑不同部位表达量的检测采用2-ΔΔCt定量方法分析[9-13]。本试验分别选择牦牛大脑皮质、小脑皮质、海马、延髓、纹状体及嗅球组织作为研究对象，以β-actin基因为对照内参基因，对NGB基因的表达进行定量研究，同时以海马的定量结果作为参照。试验数据均以“平均值±标准差”表示,应用SPSS 16.0软件计算重复样品间Ct均值及标准偏差。

2 结果与分析

2.1 NGB在牦牛脑中表达的免疫组化结果

大脑皮质：NGB阳性细胞广泛分布于大脑皮质的第Ⅰ～Ⅵ层，且数量众多，NGB免疫阳性反应强度明显高于小脑皮质、海马、纹状体、嗅球、延髓各区域(图1)。其中，颞叶听区、扣带皮质、梨状皮质中的阳性细胞较为密集，染色较强，阳性产物集中于细胞质。在大脑皮质额叶、颞叶、顶叶、枕叶等不同区域，NGB阳性表达强弱没有明显的差异。大脑髓质区域可见散在分布的NGB阳性细胞(图1-A)。

小脑皮质：浦肯野氏细胞呈NGB强阳性表达，其细胞突起中也有较强的NGB阳性反应，与浦肯野氏细胞邻近的一些神经纤维中可见较弱的NGB阳性反应。分子层中的部分神经细胞亦可见NGB阳性表达，但与浦肯野氏细胞相比，反应强度较弱。颗粒层中散在有NGB阳性表达细胞(图1-B)。小脑皮质中，NGB阳性细胞免疫阳性反应强度较大脑皮质各区弱，但明显强于海马、纹状体、嗅球、延髓各区域(图1)。

海马：NGB阳性细胞多为椎体细胞，反应部位主要存在于细胞突起中，强度较弱。在锥体细胞层外的其它区域内亦可见稀疏的NGB阳性细胞(图1-C)。

纹状体：在纹状体的尾状核区域，可见NGB阳性细胞广泛分布，免疫阳性反应强度高于海马、延髓、嗅球各区域，但较大脑皮质、小脑皮质各区域弱(图1-D)。

嗅球：成年牦牛大脑嗅球的僧帽细胞层明显，胞体大，染色呈NGB免疫阳性(图1-E)。染色强度较延髓弱，但略高于海马各区域。

延髓：NGB阳性细胞主要分布于灰质，白质中NGB阳性细胞亦有散在分布(图1-F)。

2.2 NGB在牦牛脑中表达的荧光定量结果

2.2.1 总RNA的提取 利用RNA抽提试剂盒对牦牛脑不同部位的RNA进行提取，用分光光度计检测所有样品总RNA的OD260/OD280值均在1.8～2.0，表明RNA纯度符合要求。

2.2.2 定量表达 (1)实时荧光定量RT-PCR扩增结果。在对提取的RNA进行反转录试验后，首先设置温度梯度对最佳退火温度进行确定(一般选择Ct值最小的退火温度)，得到β-actin和NGB基因的最佳退火温度均为60 ℃。最后将要分析的样品(每种样品3次重复)在同一检测条件下进行反应得到β-actin和NGB基因的扩增曲线和熔解曲线(图2，3)。

由图2可见，β-actin和NGB基因的扩增曲线均呈现“S”形，说明各基因的动力学曲线平行性整体较好，曲线拐点清楚，基线平而无明显上扬趋势。熔解曲线(图3)显示各样品熔解曲线集中。目的基因与内参基因的扩增产物的温度值均一，表明在实时荧光定量PCR过程中，荧光强度均来自于特异性的扩增产物，目的基因及内参基因没有产生非特异性扩增及引物二聚体。

(2)定量表达水平检测。NGB基因在成年牦牛脑不同部位的表达量结果(表2)显示，牦牛大脑皮质、小脑皮质、延髓、纹状体及嗅球组织中NGB基因的表达量分别是海马的262.69倍、137.00倍、3.43 倍、7.65倍和2.14倍，其中大脑皮质、小脑皮质NGB基因的表达量极显著高于海马、延髓、纹状体及嗅球(P<0.01)，且大脑皮质NGB基因的表达量极显著高于小脑皮质(P<0.01)；延髓、纹状体及嗅球组织中NGB基因的表达量显著高于海马(P<0.05)，延髓、纹状体及嗅球之间差异不显著。

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05),while different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 讨 论

本试验采用免疫组织化学染色SP法及实时荧光定量PCR技术对NGB在成年牦牛脑不同部位的分布和表达量进行了研究。结果显示，NGB在成年牦牛脑不同部位中有广泛的分布，数量多，表达强度高，提示脑红蛋白在中枢神经系统中担负着重要的功能。NGB参与神经细胞对氧的摄取和储存，能够提高神经细胞对氧的利用率[14]，在机体缺血缺氧条件下，NGB表达上调，可以对神经细胞起到保护作用，提高脑组织对缺血缺氧的耐受度，进而减少脑组织的损伤[15]。对于长期生活在高原低氧环境中的牦牛，NGB在脑不同部位的表达对于增强牦牛神经系统的氧利用率，维持脑的正常生理功能具有重要的意义。但是，NGB表达量的高低与其高原低氧环境的适应性是否存在必然的联系还有待进一步的探讨。

免疫组化结果显示，NGB在成年牦牛脑中的分布存在较大差异，大脑皮质、小脑皮质中的免疫阳性反应明显高于脑的其他部位，在脑内其他神经核团中也可见较高强度的阳性表达。脑皮质及脑内神经核团是中枢神经系统发挥功能的主要部位，对机体活动起着至关重要的作用[16]，NGB在牦牛脑皮质及功能核团中的高表达可能与其储氧功能的发挥有着密切联系，同时也反映出脑不同部位的活跃程度及耗氧量存在较大的差异。此外，NGB在牦牛脑其他部位和细胞中的分布也可能与该部位或此类细胞的耗氧性生理活动有关，但NGB是否还发挥其它的功能尚有待进一步的研究探讨。

本试验首次应用实时荧光定量PCR技术对NGB基因在牦牛脑内不同部位中的表达量进行了检测。结果显示，牦牛脑内不同部位中NGB基因的表达量有明显差异，NGB在大脑皮质中的表达最强，这与Burmester等[1]用Northern杂交和原位杂交技术研究的结果相一致，也与王航雁等[17]在人和大鼠上的研究结果一致。本研究显示，NGB基因在成年牦牛大脑不同区域的表达量有明显差异，在大脑皮质的阳性表达量极显著高于小脑皮质、海马、延髓、纹状体和嗅球，这一检测结果与大脑不同区域对缺氧损伤的敏感性一致[18]。Zivin[19]研究表明，在缺血缺氧状态下，NGBmRNA在脑内不同区域的表达程度与相应区域对缺血缺氧的敏感程度呈负相关；其中，大脑皮质对缺氧耐受时间为19.1 min，海马为12.7 min，在缺氧状态下，皮质中NGB基因的表达量为海马的4倍。NGB基因在牦牛大脑皮质中的表达量最高，表明大脑皮质对缺血缺氧的敏感性最弱，耐受性最强。相反，NGB基因在牦牛海马中的表达量最低，表明海马对缺血缺氧的敏感性最强，耐受性最弱。本研究为NGB在中枢神经系统中生理功能的研究提供了新的理论依据。

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Distribution of neuroglobin in brain of adult yak

LI Tong-fang1a,2,LIU Xia1b,2,SUN Xue-jing1a,2,DU Xiao-hua1a,2

(1 aCollegeofVeterinaryMedicine,bCollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China;2GansuKeyLaboratoryofHerbivorousAnimalBiotechnology,Lanzhou,Gansu730070,China)

【Objective】 This study aimed to explore the localization of neuroglobin (Neuroglobin,NGB) in different areas of adult yak brain.【Method】 Eight health adult yaks were selected and NGB expression in different areas (cerebral cortex,cerebellar cortex,hippocampus,medulla oblongata,striaturn,and olfactory bulb) of adult yak brain was determined using the immunohistochemical SP technique and the real-time fluorescent quantitative PCR technology .【Result】 The expression of NGB in different areas of adult yak brain had significant difference.The relative expression ofNGBgene in cerebral cortex (262.69±9.19) was significantly higher than in cerebellar cortex (137.00±7.29),hippocampus (1.00±0.22),medulla oblongata (3.43±0.76),striaturn (7.65±0.61),and olfactory bulb (2.14±1.22).【Conclusion】 The expression of NGB in different areas of adult yak brain suggested that NGB might play an important role in utilization of oxygen and physiological functions.

neuroglobin;immunohistochemistry;real-time fluorescent quantitative PCR;yak

2014-01-01

甘肃省高等学校基本科研业务费项目(2013)；甘肃省教育厅研究生导师项目(1102-04)

李同方(1989-)，男，山东济南人，硕士，主要从事动物解剖与组织胚胎学研究。E-mail：918403766@qq.com

杜晓华(1977-)，男，陕西米脂人，副教授，博士，主要从事动物解剖与组织胚胎学研究。E-mail：duxh@gsau.edu.cn

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.012

S823.8+51

A

1671-9387(2015)06-0001-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.012.html