高 巍，张晓琪，景桂霞，宋平义，南克俊，沙保勇

（1．西安交通大学医学部第一附属医院麻醉科，陕西西安 710061；2．西安交通大学医学部第一附属医院肿瘤内科，陕西西安 710061；3．西安医学院基础医学部基础医学研究所，陕西西安 710021）

我国肝癌发病率逐年升高，已居世界首位，并出现年轻人群高发的趋势［1］。手术切除是现在肝癌治疗的重要方法之一，而患者围术期及后续治疗过程中均需要控制疼痛，其中舒芬太尼是临床麻醉和疼痛治疗中最常用的镇痛药。舒芬太尼为强效阿片类镇痛药物，属于苯基哌啶类，具有稳定的时量相关半衰期，无蓄积及抑制呼吸等副作用，为取代吗啡等药物的“后起之星”［2］。阿片类药物在肿瘤治疗中的广泛使用，使人们越来越关注其对肿瘤细胞的影响。而这种影响存在双面性，既能诱发瘤细胞扩散［3-4］，又能加速肿瘤细胞的凋亡［5-7］。目前，阿片类药物对肿瘤细胞影响的研究多见于吗啡，鲜有文献报道舒芬太尼对肝癌细胞的影响及作用机制。

本实验采用体外培养人肝癌Hep3B细胞，观察舒芬太尼对肝癌细胞活性的影响，并检测Hep3B细胞周期及凋亡的变化和survivin及caspase-3蛋白的表达，以期为舒芬太尼在肿瘤治疗中的应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料 DMEM细胞培养液及胎牛血清购买自Hyclone；舒芬太尼（枸橼酸舒芬太尼注射液）购买自宜昌人福药业有限公司，批号090501；细胞周期及Annexin-FITC／PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；其他试剂耗材，如非特殊说明，均购买自Sigma。

1．2 细胞培养 人肝癌Hep3B细胞由西安交通大学泌尿外科及肿瘤科实验室提供，DMEM培养液（每500mL培养液中需添加50mL的胎牛血清）、37℃和50mL／L CO2培养。培养好的细胞经计数后用于后续实验。

1．3 细胞活性检测 将计数后的细胞悬液加入96孔板中，每孔100μL（约5×103个细胞）。待Hep3B细胞贴壁后，加入0．01、0．1、1、5、10、15μmol／L的舒芬太尼，分别培养24、48、72h。孵育完成后，弃去96孔培养板中的培养液并用PBS清洗。加入含有5mg／mL MTT的DMEM培养液继续培养4h，孵育完成后弃去培养液，加二甲基亚砜振荡溶解结晶物。以630nm为参照，测量570nm处的吸光度值。所有实验以正常生长的Hep3B细胞为对照组。

1．4 细胞周期及细胞凋亡检测 将计数后的细胞悬液加入6孔板中，每孔细胞约5×104个。待Hep3B细胞贴壁后，加入1、5、10、15μmol／L的舒芬太尼，培养48h。孵育完成后，消化并收集每孔的细胞，用4℃预冷的PBS缓冲液清洗。700mL／L冷乙醇固定，4℃过夜，离心弃去固定液，PBS清洗2次，用含100 mg／L RNA酶和10mg／L碘化丙锭（PI）的 PBS溶液重悬细胞。用FACS calibur流式细胞仪进行计数，通过Multiplus软件分析细胞周期。

重复细胞周期检测中细胞培养、处理、固定、清洗的过程，根据AnnexinV／PI双标记试剂盒操作步骤，向重悬细胞中加入PI和FITC，室温避光反应后，通过流式细胞仪进行分析，计算凋亡率。

1．5 survivin和caspase-3蛋白表达测定 提取Hep3B细胞总蛋白，并用BCA定量。蛋白样品加loading buffer后煮沸使其充分变性，用SDS-PAGE电泳分离目标蛋白，经蛋白转膜、封闭、一抗（1∶5 000）及二抗（1∶10 000）孵育后，进行化学发光显影。收集图像后，灰度扫描蛋白条带，进行吸光度值分析。

1．6 统计分析 所有实验设置3～6个复孔，进行3次独立实验。所有的结果以平均数±标准差表示，通过SPSS 13．0进行数据统计分析，用t检验及ANOVA检测，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 舒芬太尼对Hep3B细胞活性的影响 舒芬太尼0．01、0．1、1、5、10、15μmol／L组的 Hep3B细胞，共同孵育24、48、72h，与对照组细胞相比，Hep3B细胞活性随舒芬太尼浓度的增加而减小；当舒芬太尼浓度大于1μmol／L，孵育时间超过48h，肝癌细胞活性出现显著性降低（P＜0．05），变化呈现浓度依赖性（图1）。如当浓度为5、10、15μmol／L的舒芬太尼分别与肝癌Hep3B细胞孵育72h后，肝癌细胞活性分别 降 低 到 （82．8±3．2）% （P＝0．012）、（75．9±2．4）%（P＝0．009）和（70．1±2．8）%（P＝0．001）；而舒芬太尼与Hep3B细胞共同孵育24h，细胞活性未显著性改变（图1）。

图1 不同浓度舒芬太尼对Hep3B细胞活性的影响Fig．1 The effects of different concentrations of Sufentanil on Hep3Bcell viability

2．2 舒芬太尼对Hep3B细胞周期的影响 基于细胞活性实验结果，选取1、5、10和15μmol／L舒芬太尼处理48h，通过FACS calibur流式细胞仪检测Hep3B细胞周期变化，与正常对照组相比，随着舒芬太尼浓度的增加，G0／G1期的比例显著性增加，S期的比例显著性降低，而G2／M期比例变化无统计学意义（图2）。可见，舒芬太尼能将Hep3B细胞停滞在G0／G1期，抑制了细胞由DNA合成前期向DNA合成期的过渡。

图2 不同浓度舒芬太尼对Hep3B细胞周期的影响Fig．2 The effects of Sufentanil of different concentrations on Hep3Bcell cycle

2．3 舒芬太尼对Hep3B细胞凋亡的影响 舒芬太尼（1～15μmol／L）处理 Hep3B细胞48h后，用AnnexinV／PI双染法检测肝癌细胞的凋亡情况并计算其细胞凋亡率。舒芬太尼能诱导Hep3B细胞出现凋亡，且当舒芬太尼浓度大于5μmol／L时，凋亡率显著增加，呈剂量依赖性关系，且均与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05，图3）。

2．4 舒芬太尼对survivin、caspase-3蛋白表达的影响 舒芬太尼处理Hep3B细胞48h后，Western blot检测结果表明，与正常对照组相比，经1、5、10和15μmol／L舒芬太尼处理后，Survivin表达量逐步下调，Caspase-3表达量逐步升高，量化结果显示差异有统计学意义（图4）。

3 讨 论

图3 不同浓度舒芬太尼对Hep3B细胞凋亡的影响Fig．3 The effects of Sufentanil of different concentrations on the apoptosis of Hep3Bcells

我国癌症患者有450万人，一半以上的患者有不同程度的疼痛，严重影响患者的生活质量［8］。基于世界卫生组织提出的“三阶梯治疗”方案，中、重度晚期癌症患者应主要给予强效阿片类药物（如舒芬太尼等）镇痛治疗［9］。舒芬太尼等阿片类药物在癌症患者围手术期、术后镇痛及癌性疼痛治疗中广泛使用，且其没有“封顶效应”，对控制肿瘤患者中、重度癌痛有良好效果。因此，本研究观察舒芬太尼对肝癌细胞的作用，而且基于其镇痛无封顶效应，采用舒芬太尼的浓度跨度为0．01～15μmol／L，远超出其镇痛的临床使用浓度0．001～0．015μmol／L。

图4 舒芬太尼对Hep3B细胞survivin及caspase-3蛋白表达的影响Fig．4 The effects of Sufentanil on the expressions of survivin and caspase-3protein in Hep3Bcells

本研究结果显示，随着舒芬太尼浓度的增加，肝癌细胞活性降低，细胞周期停滞在G0／G1期，且细胞凋亡增多。这与另一种强效阿片类药物吗啡的一些研究结果很相似，如吗啡能将胰腺癌MCF-7细胞阻滞在G0／G1期［10］，能将胃癌细胞 MGC-803阻滞在G2／M期［11］，能诱导鼻咽癌CNE-2细胞出现明显的细胞凋亡现象［7］。

Survivin是一种凋亡抑制蛋白，在人类多种肿瘤中均有表达，且有抑制细胞凋亡的作用。Survivin主要在G2／M期强表达，而在之后的G1期，其mRNA和蛋白水平迅速下降［12］。Survivin能抑制细胞凋亡的关键蛋白酶caspase-3的合成，从而抑制细胞凋亡［13-14］。本研究结果显示舒芬太尼使肝癌细胞细胞凋亡增多，而survivin蛋白处于一个低水平表达，caspase-3表达增多。

总之，本实验用不同浓度的舒芬太尼处理体外培养的人肝癌Hep3B细胞，发现舒芬太尼能降低肝癌细胞活性，潜在的作用机制之一可能是阻滞细胞到G0／G1期并促进细胞凋亡。本研究明确了舒芬太尼对人肝癌Hep3B细胞的抑制作用，为舒芬太尼在肿瘤治疗中的应用提供了一定的理论和实验依据。

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