张杰波，刘映峰，缪 绯，刘 芃

（南方医科大学珠江医院心血管内科，广东广州 510282）

在急性心肌梗死患者的再灌注治疗中，现阶段所采用溶栓或冠脉介入治疗，都可能发生心肌缺血／再灌注 损 伤 （myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。缺血／再灌注（I／R）的机制至今仍未完全阐明，临床上尚无有效的治疗方法。促红细胞生成素（EPO）的生物多效性已被广泛证实，在I／R、炎症、神经创伤等多种生物模型中，EPO具有明显组织保护作用，尤其见于MIRI［1-2］。本研究通过体外培养乳鼠心肌细胞株，建立H／R细胞损伤模型，观察EPO对细胞凋亡及Omi／HtrA2转位的影响，并用特异性siRNA干扰片段干扰Omi／HtrA2表达，以探讨Omi／HtrA2在EPO抗凋亡调控机制中的核心作用。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂 H9C2细胞株（南方医科大学珠江医院实验室提供）；胎牛血清、DMEM-高糖培养基、青霉素、PBS磷酸钾缓冲液、重组人促红素注射液（CHO细胞）购自山东科兴生物制品有限公司；cell-Titer96AQ单溶液细胞增殖检测试剂盒购自Promega Corporation；乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；cleaved caspase-3多抗、GAPDH 单抗、COX IV 单抗、Omi／HtrA2单抗购自Cell Signaling Technology；Pluslight ECL kit（ECL发光试剂盒）购自Forevergen bioscience；线粒体胞质分离试剂盒购自QIAGEN公司；HRP标记二抗购自永诺生物公司。Trizol购自Invitrogen；ReverTra Ace qPCR RT Kit购自 Toyobo Biochemicals（Japan）；GoTaq®qPCR Master Mix购自Promega。

1．2 EPO对H9C2细胞缺氧-复氧的影响

1．2．1 实验分组 将H9C2细胞分为：①对照组（Ctrl）：细胞用DMEM-高糖培养基正常培养26h，不作任何处理；②缺氧复氧组（H／R组）：将待处理细胞、厌氧袋及氧气指示剂放入厌氧罐，将厌氧罐置于细胞培养箱，待氧气指示剂从浅紫色变成粉红色，开始计时缺氧时间，缺氧时间定为2h，重新将细胞放置培养箱即为复氧状态，复氧24h；③H／R＋EPO组（EPO）：同 H／R组缺氧处理2h后，分别加入5、10、20IU／mL的EPO，然后复氧24h。

1．2．2 细胞上清液LDH浓度的检测 各组细胞培养结束后，提取上清液按照LDH细胞毒性检测试剂盒说明书操作测量细胞LDH释放率：

1．2．3 Western blot检测cleaved caspase-3表达提取细胞蛋白，用Bradford法定量后，采用150g／L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜上，50 g／L脱脂牛奶封闭后，将相应的一抗cleaved caspase-3（cell signaling ＃9661，1∶1 000），4℃ 过夜后，用TBST每次7min洗2次后，用相应稀释好的二抗（HRP标记二抗，1∶5 000，Forevergen）室温下孵育1～2h，TBST每次7min洗涤3次后，进行化学发光显影（ECL，Forevergen）。用Image J分析目标条带的吸光度值。以GAPDH（HC301，1∶5 000）作为内参照，比较不同处理后的蛋白表达差异。

1．2．4 Western blot检测线粒体及细胞质 Omi／HtrA2蛋白表达 选取EPO 20IU／mL组细胞为实验对象，按照线粒体胞质分离试剂盒说明书，分离H9C2细胞胞质及线粒体，采用 Western blot检测线粒体和胞质中Omi／HtrA2蛋白。

1．3 si-HtrA2干扰细胞及对缺氧-复氧的影响

1．3．1 si-HtrA2细胞转染和干扰效果检测 si-HtrA2片段及对照片段［3-4］由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，干扰序列：5′-GAGGTGATTGGAGTGAACACCATGA-3′，对 照 序 列：5′-AACAGTCGCGTTTGCGACTGG-3′。

采用小分子干扰脂质体法提前48h进行细胞转染，按Trizol试剂盒提供的操作步骤提取细胞总RNA，按照RT-PCR试剂盒进行cDNA逆转录及qPCR扩增操作。Omi／HtrA2上游引物为5′-AGTGCGAGTGAGGCTACCTA-3′，下游引物为5′-TGG CAACAACAAACTCCCCT-3′；GAPDH 作为内参，上游引物5′-GCAAGAGAGAG GCCCTCAG-3′，下游引物5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′。反应结束后，用 MiniOpticon System and Opticon Monitor软件进行qPCR的相对定量分析。收集蛋白用Western blot检测Omi／HtrA2蛋白表达水平以验证HtrA2的干扰效果。

1．3．2 Omi／HtrA2干扰处理及对LDH 和caspase-3的影响 成功转染48h后将细胞分组：①Ctrl组：转染对照片段，正常培养26h，不作任何处理；②H／R组：转染对照片段，缺氧2h，复氧24h；③si-HtrA2组：转染干扰片段，缺氧2h，复氧24h。各组细胞上清液LDH释放率及cleaved caspase-3表达的检测方法同前文1．2。

1．4 统计学处理 应用SPSS 13．0软件进行统计分析，计量资料进行正态性检验，符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD法检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 EPO对LDH浓度的影响 H／R组细胞上清液LDH浓度较Ctrl组明显上升，EPO处理组较H／R组下降，随着EPO浓度的升高，LDH释放逐渐下降，各组间差异均有统计学意义（P＜0．05，图1）。

图1 各组细胞上清液LDH释放率Fig．1 The release rate of lactate dehydrogenase（LDH）in cell supernatant in all groups

2．2 EPO对细胞cleaved caspase-3表达的影响cleaved caspase-3在H／R组细胞中表达较Ctrl组升高（P＜0．05），在EPO处理组中表达较 H／R组下降，且下降趋势具有浓度依赖关系，各组间差异均有统计学意义（P＜0．05，图2）。

图2 EPO对培养细胞H9C2细胞的cleaved caspase-3表达的影响Fig．2 Effect of EPO on the expression of cleaved caspase-3 in cultured H9C2cell line

2．3 EPO对H9C2细胞胞质及线粒体Omi／HtrA2蛋白表达的影响 Ctrl组Omi／HtrA2蛋白主要在线粒体（Mito）中表达，在细胞胞质（Cyto）中表达较少；H／R组Omi／HtrA2蛋白表达在胞质中表达较多（向胞质发生转位）；EPO（20IU／mL）组 Omi／HtrA2在线粒体中表达较多（向胞质转位减少），以上差异均有统计学意义（P＜0．05，图3）。

图3 各组H9C2细胞胞质及线粒体Omi／HtrA2的相对表达水平Fig．3 Expression of Omi／HtrA2was measured in cytoplasm and mitochondria in H9C2

2．4 Omi／HtrA2干扰效果检测 H／R 组的 Omi／HtrA2蛋白和mRNA表达与Ctrl组相比无明显变化，差异无统计学意义（P＞0．05，图4）；干扰Omi／HtrA2组较Ctrl组及H／R组均明显减少，差异有统计学意义（P＜0．05，图4）。提示si-HtrA2能有效干扰 Omi／HtrA2表达。

图4 Omi／HtrA2干扰时细胞Omi／HtrA2蛋白（A）和mRNA（B）表达的变化Fig．4 Expression of Omi／HtrA2（A）and mRNA （B）

2．5 干扰Omi／HtrA2后H／R细胞上清液LDH浓度的变化 H／R组细胞上清液LDH浓度较对照组明显上升，si-HtrA2组细胞较H／R组下降，各组间差异均有统计学意义（P＜0．05，图5）。

图5 干扰Omi／HtrA2后H9C2细胞培养上清液LDH的释放率Fig．5 LDH release assay after silencing of Omi／HtrA2in cell supernatant

2．6 Omi／HtrA2干扰对细胞cleaved caspase-3表达的影响 H／R组细胞表达cleaved caspase-3较对照组升高（P＜0．05），si-HtrA2组表达较 H／R组下降，各组间差异均有统计学意义（P＜0．05，图6）。

图6 各组细胞cleaved caspase-3的相对表达水平Fig．6 Relative expression level of cleaved caspase-3in different groups

3 讨 论

细胞凋亡是MIRI的重要机制，其凋亡过程受基因调控，主要由caspase级联反应过程控制。而caspase-3作为该级联反应共同的下游关键因子，执行死亡程序，被称为“杀手”蛋白。EPO是在人体肾脏及肝脏分泌的一种耐热酸性糖蛋白激素，它主要作用于红系祖细胞，促进其增生、分化和成熟，对体内红细胞的分化成熟发挥至关重要的作用。但近来研究发现，EPO具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、促进上皮细胞增生等作用［5-7］。在以往的动物实验中，EPO被证实可以减轻急性心肌梗死大鼠模型的心肌梗死面积和透壁程度［8-9］，BULLAR 等［9］在 大 鼠离体心缺 血35 min再灌注2h的实验中，发现EPO能够减少MIRI；CAI等［10］在大鼠离体心 MIRI实验中发现EPO能够促进心脏功能恢复，减少细胞凋亡。然而，EPO抗细胞凋亡的作用机制尚不明确。本研究中H9C2细胞经过H／R处理后LDH、caspase-3表达增加，而EPO可减少H／R细胞的LDH、caspase-3的表达，提示EPO对H／R诱导的H9C2心肌细胞凋亡有保护作用。

Omi／HtrA2蛋白是一种新发现的促凋亡蛋白，在细胞正常生理情况下存在于线粒体膜间隙，当细胞受到凋亡信号刺激时，包含458个氨基酸残基的完整Omi／HtrA2通过自我加工，去除N末端133个氨基酸残基的跨膜部分，形成成熟的 Omi／HtrA2［11］，穿过线粒体膜进入胞质，通过与X-连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）结合，竞争性抑制XIAP与caspase-9的结合，进而激活处于下游的caspase-3蛋白表达。

成熟野生型Omi／HtrA2转位可以有效诱导caspases的活性以及增加XIAP的降解［12］，而利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）抑制 Omi／HtrA2的表达则可以出现相反的现象，进而抑制细胞凋亡。CILENTI等［13］发现，在用顺铂处理的肾细胞中Omi／HtrA2表达明显升高，且伴随着XIAP的含量降低。用RNAi技术破坏内生性Omi／HtrA2，顺铂介导的肾细胞凋亡明显减少。说明Omi／HtrA2在顺铂介导的肾细胞凋亡中起到重要作用，通过RNAi阻断Omi／HtrA2蛋白可减少凋亡。本实验结果显示，H／R组caspase-3蛋白及胞质中Omi／HtrA2蛋白表达较Ctrl组明显增强，EPO组caspase-3蛋白及胞质中Omi／HtrA2蛋白表达水平虽然高于Ctrl组，但较H／R组明显减少；H／R组细胞经RNAi干扰Omi／HtrA2后，LDH释放下降，caspase-3蛋白表达减少，提示当胞质中Omi／HtrA2蛋白减少，凋亡蛋白酶（caspase）激活受到抑制。这表明EPO在H／R心肌细胞中可能是通过抑制Omi／HtrA2蛋白从线粒体到胞质的转位，抑制caspases酶联反应，减少细胞凋亡的发生。这为临床MIRI的治疗提供了新的实验依据及干预靶点。

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