胡培静，杜 媛，王 娅，王亭忠，王娟娟，陈春燕，马爱群

（西安交通大学医学部第一附属医院心血管内科，陕西省分子心脏病学重点实验室，环境与疾病相关教育部重点实验室，陕西西安 710061）

SCN5a编码心脏电压依赖性钠通道Nav1．5的α亚基，Nav1．5介导的内向电流INa对心肌细胞动作电位的产生和传导有着重要的作用，决定着心脏电脉冲的兴奋性和传导速度［1］。SCN5a基因突变与多种心律失常的发生有关，如功能获得性突变，引起INa增加，可以导致3型长 QT 综合征（LQT3）［2-4］，而功能缺失性突变，引起INa降低，可以导致多种心律失常，包括Brugada综合征（Brugada syndrome，BrS）、进行性心脏传导系统疾病、病态窦房结综合征及房颤等［5］。其中，R104W 是SCN5a基因的一种错义突变，可以引起Brugada综合征，此突变是由Jerome Clatot等人在一位33岁无症状的男性患者发现的，其有典型的BrS 1型心电图的表现：ST段抬高、V1导联T波扭转以及不完全性右束支传导阻滞。R104W突变引起通道蛋白发生转运障碍，蛋白质过多滞留于内质网，导致INa降低，并对野生型SCN5a有明显的负显性抑制作用［6］，目前尚未有关于R104W突变纠正的研究。我们设计的本实验拟在野生型SCN5a的基础上，用一步法构建SCN5a-R104W突变，并用分子生物学及电生理方法对其进行验证，为后续有关突变纠正措施的研究提供基础。

1 材料与方法

1．1 材料 人胚胎肾细胞（HEK 293）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库／中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，野生型人pEGFPSCN5a质粒和DH5α细菌来自于本实验室，DMEM培养基、胎牛血清及Lipofectamine TM3000购自Invitrogen公司，QuickChange定点突变试剂盒购自Agilent公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自Qiagen公司，兔抗hNav1．5单克隆抗体购自Alamone公司，山羊抗兔HRP标记二抗购自Santa Cruz公司，引物合成及测序由北京奥科生物技术有限公司提供。

1．2 突变体pEGFP-SCN5a-R104W的构建 根据定点突变试剂盒要求，设计引物序列如下：5′-TGGTGGCACTGAACCGAAGATGGTCTTGCC-3′，5′-GGCAAGACCATCTTCTGGTTCAGTGCCACCA-3′，引 入突变点310C＞T，按照试剂盒说明进行点突变操作，然后提取质粒并测序。

1．3 基因转染 HEK 293细胞在含有100mL／L胎牛血清的DMEM培养基培养，转染前1d，将细胞铺于35mm的培养皿中，24h后待细胞生长至密度约为70%～80%时，采用Lipofectamine TM3000脂质体转染 法，分 别 转 入 pEGFP-SCN5a-WT 2μg、pEGFPSCN5a-R104W2μg或pEGFP-SCN5a-WT 1μg＋pEGFP-SCN5a-R104W1μg后在37℃下继续培养。

1．4 Western blotting检测蛋白质表达 转染24h后，收集细胞提取蛋白质，进行蛋白定量并变性，然后进行SDS-PAGE电泳，按120V、2h的条件转膜，用5g／100mL的TBST脱脂奶粉封闭1h，加入兔抗Nav1．5单克隆抗体（1∶500）4℃过夜孵育。然后吸去一抗，TBST漂洗3次，每次10min。再加入山羊抗兔二抗（1∶20 000）后室温孵育1h。吸去二抗，TBST漂洗3次，每次10min，然后用Chemi Doc-XRS发光仪上成像。

1．5 全细胞膜片钳记录INa采用P-97微电极拉制仪（Sutter公司）拉制玻璃微电极，电阻为3～5MΩ。电极 内 液 成 分 为 （mmol／L）：CsCl 130，NaCl 10，EGTA 10，HEPES 10，采用 CsOH 调节pH 至7．2；电极外液成分为（mmol／L）：NaCl 140，KCl 4，CaCl21．8，MgCl21，HEPES 10，glucose 10，采用 NaOH 调节pH至7．4。选择状态良好的单个细胞建立GΩ封接，再给予负压破膜形成全细胞模式，然后记录INa。

2 结 果

2．1 DNA测序证实突变位点成功建立 DNA测序结果显示，与野生型pEGFP-SCN5a相比，pEGFPSCN5a-R104W突变体第310位由C变为T（对应104位氨基酸由R转变为 W），而其他碱基序列未发生改变，提示R104W突变体构建成功（图1）。

图1 DNA测序图显示R104W突变体第310位由C变为TFig．1 DNA sequencing result showed that the base on 310was changed from C to T of R104Wmutation

2．2 SCN5a-R104W 突变体蛋白质表达降低Western blotting结果显示，无论是转染pEGFPSCN5a-WT还是转染pEGFP-SCN5a-R104W突变体后，HEK 293细胞均表达钠通道蛋白SCN5a，但转染pEGFP-SCN5a-R104W突变体后SCN5a表达量显著降低（图2），符合钠通道转运障碍型突变的蛋白表达特征。

2．3 SCN5a-R104W突变体蛋白质表达于胞质 荧光显微镜观察结果显示，pEGFP-SCN5a-WT转染后主要表达于细胞膜上，而pEGFP-SCN5a-R104W突变体转染后主要表达于胞质，细胞膜上不表达。将pEGFP-SCN5a-WT和pEGFP-SCN5a-R104W共转染细胞后可见既表达于胞质，也表达于细胞膜上，但是与单纯转染pEGFP-SCN5a-WT相比，细胞膜上表达量显著降低（图3），这也进一步证实SCN5a-R104W突变体符合转运障碍型突变特征。

图2 Western blotting结果显示SCN5a通道R104W突变体蛋白表达降低Fig．2 Western blotting result showed that protein expression of the R104Wmutation was reduced

2．4 SCN5a-R104W突变体不表达INa膜片钳记录结果显示转染pEGFP-SCN5a-WT的HEK 293细胞表达特征性INa，而转染pEGFP-SCN5a-R104W突变体的 HEK 293细胞不能记录到INa。将pEGFPSCN5a-WT和pEGFP-SCN5a-R104W共转染细胞后，同样可以记录到与pEGFP-SCN5a-WT转染后形态相似的INa，但是其峰值电流明显降低，说明SCN5a-R104W突变体对SCN5a-WT通道有负显性抑制作用（图4）。

3 讨 论

图3 荧光显微镜观察结果显示pEGFP-SCN5a-WT和pEGFP-SCN5a-R104W的表达定位Fig．3 Localization of pEGFP-SCN5a-WT and pEGFP-SCN5a-R104Wexpressions

图4 膜片钳结果显示R104W突变体不表达INa且对野生型通道有负显性抑制作用Fig．4 Patch clamping result showed that no sodium current was recorded from the cells expressing SCN5a-R104Wmutant channel，and SCN5a-R104Wexerted dominant-negative effect on SCN5a-WT channel

SCN5a编码的电压依赖性钠通道Nav1．5主要参与心肌细胞动作电位快速去极化过程，同时在平台期也发挥部分作用［7］。SCN5a基因突变与3型长QT综合征（LQT3）、Brugada综合征、病态窦房结综合征及房颤等心律失常的发生有关。

LQT综合征共有LQT1～LQT13个亚型，其中，LQT3的发生与SCN5a突变有关。LQT综合征是一种心脏动作电位复极延长，体表心电图表现为QT间期延长，易发生室性心动过速、室颤、特别是TdP（尖端扭转型室性心动过速）等恶性心律失常的疾病［8］。Brugada综合征是1992年由Brugada兄弟首先发现并命名的，其特点是反复发生的心脏骤停、非典型的右束支传导阻滞以及体表心电图V1-V3导联持续性ST段抬高而心脏的结构正常［9］，目前发现了13个可以导致Brugada综合征的基因，其中SCN5a基因上有300多个可以引起Brugada综合征的突变位点［10］。根据SCN5a突变位点不同可以分为5类：①错义突变，约占66%，如L325R、R1432G、T1620M、C1850S；②移码突变，约占13%，包括缺失、插入突变等，如delKl479；③无义突变，约占11%，如Q55X、Q419X；④剪接突变，约占7%；⑤其他突变，约占3%。突变位置主要集中在钠通道的跨膜区，约占Brugada综合征基因突变病例的20%［11］。对引起Brugada综合征的SCN5a突变进行外源表达研究后发现，钠通道呈现不同程度的功能下降，其机制包括：①钠通道表达减少：通道蛋白合成障碍或细胞内蛋白转运障碍，导致细胞膜表面功能性钠通道表达减少；②钠通道电流动力学异常：钠电流激活、失活、恢复的电压依赖性和时间依赖性改变，如激活延迟、失活加快、复活减慢，或进入缓慢恢复的中间失活状态，这些改变均可导致钠离子通道功能失调；③既有钠通道表达下降，又存在通道动力学特征的改变。钠通道功能降低，电流减小，导致心脏特别是右心室及右心室流出道传导速度减慢，从而诱发折返性心律失常［12］。

Brugada综合征的治疗方法主要包括药物治疗和心律转复除颤器的植入。药物治疗中主要应用的是奎尼丁，其通过减小Ito电流而减少Brugada综合征患者心律失常的发生［13］，尚未有药物能治愈Brugada综合征，尤其是针对突变类型的治疗方法。心律转复除颤器植入是唯一已证实对Brugada综合征治疗有效的方法，此外射频消融术也是一种新的治疗方法［14］。SCN5a错义突变G1406R可以导致Brugada综合征，研究发现抗心律失常药美西律可以在细胞水平纠正G1406R突变［15］，虽然在体内美西律是否同样能纠正此突变进而使患者的心电指标恢复正常还有待进一步研究，但此研究至少为Brugada综合征的治疗提供了一种可能有效的新方法。目前尚无关于R104W突变纠正方法的报道，因此，体外构建R104W突变载体，深入研究R104W引起Brugada综合征的分子机制，进而探索其可能的特异性纠正方法，对于因该突变导致的Brugada综合征的防治具有重要的理论及实际意义。

定点诱变是分子生物学研究中常用的方法，本实验中应用的一步法基因诱变技术是以PCR为基础的定点突变技术，以反向PCR为基础，以含有目的基因的环状质粒为模板，用2个5’端相邻且磷酸化的诱变引物进行反方向延伸，扩增产物再用DpnⅠ酶纯化（DpnⅠ酶降解甲基化或半甲基化的只含有1条模板链的模板链，而在体外合成的突变链不受DpnⅠ酶的降解）。与其他定点突变方法相比，一步法基因诱变法步骤简单、花费低、效率高且成功率高。本实验通过一步法基因诱变技术，成功将SCN5a基因序列上第310位的C诱变为T，使其蛋白质序列上第104位的精氨酸（R）突变为色氨酸（W），Western blotting法及膜片钳记录均证实R104W突变体符合转运障碍型突变的特征：与野生型SCN5a相比，R104W的蛋白表达与电流均降低，原因可能是突变引起蛋白质的转运发生障碍，细胞膜上通道蛋白表达降低，从而降低了INa，并导致Brugada综合征。

本研究采用一步法成功构建pEGFP-SCN5a-R104W突变体，为后续探索R104W突变体的纠正方法研究奠定了基础。

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