李 飞，孙亚凌，成祥林，蔡光欣，蔡新宇，徐晓明，朱占胜



天麻素调节癫疒间大鼠海马炎症信号通路的抗癫疒间机制研究

李 飞，孙亚凌，成祥林*，蔡光欣，蔡新宇，徐晓明，朱占胜

目的 探讨天麻素调节戊四氮(PTZ)致癫疒间大鼠海马炎症信号通路的抗癫疒间机制。方法将40只成年Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC)、癫疒间模型组(PTZ)、天麻素大剂量组(Gh)和天麻素小剂量组(Gs)，观察四组大鼠的行为学和脑电图的变化，应用Western blot检测p38MAPK蛋白表达，ELISA方法测定大鼠海马IL-1β、IL-2、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。结果与PTZ组相比，Gh组大鼠癫疒间发作程度、脑电图改变、海马p38MAPK蛋白的表达和部分炎性细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量明显减少(P<0.01)。结论天麻素可通过降低癫疒间大鼠海马p38MAPK蛋白的表达、抑制部分炎性细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的分泌，从而影响炎症信号通路，以达到对抗癫疒间的效果。

癫疒间；戊四氮；天麻素；p38MAPK蛋白；细胞因子

0 引言

全球约有3 000万癫疒间患者，我国约有650万，每年新增100万左右[1]，癫疒间目前的治疗仍以药物治疗为主，且主要为西药，长期服用难以坚持，患者依从性较差，因此，必须寻找有效、低毒的治疗药物。天麻为传统中药，长期作为治疗癫疒间的主要药物之一，其有效成分天麻素具有抗炎、抗氧化作用[2]，笔者临床应用和前期动物实验均发现天麻素有拮抗癫疒间的作用，但是其具体机制需要进一步阐明。本研究旨在通过观察两种浓度的天麻素对戊四氮(PTZ)致癫疒间大鼠行为学、脑电图、p38MAPK蛋白表达及部分细胞因子如IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的影响，探讨天麻素调节癫疒间大鼠海马炎症信号通路的抗癫疒间机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 戊四氮及多聚甲醛均为Sigma公司产品，ELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供，p38MAPK抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，天麻素(C13H18O7)由江苏宝泽堂医药科技有限公司提供(批号:20100801,纯度:99.2%)。

1.2 动物

1.2.1 分组与处理 清洁级健康雄性Wistar大鼠(长江大学医学院动物中心提供)40只，体重280～340 g。随机分为正常对照组(NC组)、PTZ组(戊四氮)、Gh组(天麻素大剂量)、Gs组(天麻素小剂量)，每组10只。正常分笼饲养于正常昼夜环境中，正常进食水。实验室安静、通风、空气清洁，温度为21～23 ℃，湿度为42%～45%。

1.2.2 动物模型制备 NC组腹腔内给予0.9%(质量分数)生理盐水10 mL/kg，1次/d，周期为10 d，周期第8、9、10天时，腹腔注射0.9%(质量分数)生理盐水45 mL/kg，1次/d；PTZ组腹腔内给予0.9%(质量分数)生理盐水10 mL/kg，1次/d，周期为10 d，第8、9、10天时，每天腹腔注射戊四氮稀释液(5 g/L)40 mL/kg[3]；Gh组腹腔内给予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期为10 d。第8、9、10天时，每天腹腔注射戊四氮稀释液(5 g/L)40 mL/kg；Gs组腹腔内给予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期为10 d。第8、9、10天时每天腹腔注射戊四氮稀释液(5 g/L)40 mL/kg。四组于实验周期第10天终止，完成注射后均观察2 h，并记录脑电图。

1.2.3 脑电图记录 清醒状态下将大鼠固定，采用头皮针电极，双极导联法(额-顶)连接。电极分别取两眼连线中点(额叶)及两耳连线中点(顶叶)插入固定,鼻根部接地线。

1.2.4 行为学观察 参照Racine癫疒间发作行为标准[4]进行观察记录：Ⅰ级：面肌抽动；Ⅱ级：节律性动头；Ⅲ级：前肢抽搐；Ⅳ级：躯干及前肢阵挛；Ⅴ级：四肢抽搐、全身阵挛。

1.2.5 标本采集与处理 观察1 h后，四组大鼠均行心脏灌注固定、断头取脑，依文献[4]确定脑及海马的部位与形态，制备海马组织匀浆。

1.2.6 指标测定 Western blot检测p38MAPK表达。ELISA试剂盒：严格按照说明书进行操作，测定标本中大鼠海马组织IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的水平。

1.2.7 统计学分析 数据以表示，组间比较应用方差分析，两两比较采用q检验，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 行为变化 PTZ组大鼠给药后，平均56 s左右出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、节律性点头、肢体抽搐等表现，其中7只出现Ⅴ级发作，2只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作。Gh组大鼠给药以后平均12 min左右出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、节律性点头、肢体抽搐等表现，其中1只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作，6只出现Ⅱ级发作，2只出现Ⅰ级发作。NC组给药前后均无明显变化。PTZ组与Gh、Gs组比较，PTZ组与NC组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 四组大鼠行为学改变比较

2.2 脑电图变化 NC组大鼠脑电图表现为α波或β波，PTZ组10只大鼠均出现阵发性疒间性放电，表现为高电位的棘波、尖波、棘-慢复合波、尖-慢复合波，Gh、Gs组部分大鼠有尖波、棘-慢复合波、尖-慢复合波出现，PTZ组与NC组比较，Gh、Gs组与PTZ组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，Gh组与Gs组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 四组大鼠脑电图改变比较

2.3 p38MAPK蛋白和TNF-α检测结果 Gh、Gs、NC组大鼠海马组织p38MAPK蛋白和TNF-α的表达均低于PTZ组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 四组大鼠海马p38MAPK蛋白表达和TNF-α测定

2.4 ELISA检测结果 PTZ组大鼠海马组织中IL-1β、IL-2、IL-6含量高于Gh、Gs、NC组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 四组大鼠海马部分白介素指标测定(mg/L)

3 讨论

癫疒间发病机制复杂，炎症机制在癫疒间的发病中占有重要的地位，许多神经递质和细胞因子在其中发挥重要作用，而天麻素具有抗炎作用，并且对癫疒间具有治疗作用。有研究表明，p38MAPK通路在炎症反应的上游起调控作用，可以磷酸化ATF2N端活化区域69、7l位的苏氨酸，导致其转录活性升高，与靶基因顺式元件结合增强，从而调节包括IL-1、IL-6、TNF-α等多种炎性细胞因子在内的基因表达[5]。同样，本研究结果显示，PTZ诱导的癫疒间大鼠p38MAPK蛋白表达增高，信号转导通路被激活而Gh、Gs组p38MAPK表达减少，且随着天麻素剂量增加，p38MAPK表达逐渐减少，呈现剂量依赖性保护效应，提示p38MAPK通路参与PTZ诱导的癫疒间大鼠发作后的炎症病理过程，天麻素可抑制其表达。

许多细胞因子参与了癫疒间的发病过程，其在癫疒间发病中起促进和抑制作用，而促进癫疒间发展的细胞因子主要有IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α，其促进癫疒间发展的机制可能为：①抑制神经胶质细胞内谷氨酰合成酶的活性；②兴奋性氨基酸活性的增强；③刺激神经胶质细胞增生；④诱导神经胶质细胞产生其他细胞因子；⑤提高海马锥体细胞的兴奋性；⑥减弱抑制性突触后电位，从而导致异常放电[6-7]。IL-2在中枢神经中具有促进神经及胶质细胞生长的作用，同时调节和影响神经递质的传递及激素的释放分泌[8]。本研究结果显示，PTZ组IL-lβ含量显著高于NC组(P<0.01)，PTZ组IL-1β的异常升高为自身所致，继而异常升高的其他细胞因子又参与了癫疒间的病理过程。另外，PTZ组IL-2、IL-6表达高于Gh、Gs、NC组(P<0.01)；Gh、Gs组IL-2、IL-6表达高于NC组(P<0.01)，但低于PTZ组；Gh组和Gs组比较不同浓度的天麻素对IL-1β、IL-2、IL-6的表达，高浓度的天麻素可减少其表达(P<0.05)。提示PTZ组中细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6参与了疾病的发病过程，与癫疒间疾病具有相关性；而与模型对照组比较，Gh组IL-1β、IL-2、IL-6值明显降低，提示天麻素具有抗炎作用，可有效减轻炎症反应，保护脑组织，减轻脑损害。Gh组中PTZ致疒间大鼠脑电图波幅及频率明显降低，也较好地佐证了上述结论。同时，PTZ组TNF-α高于Gh、Gs、NC组(P<0.01)；Gh、Gs组TNF-α表达高于NC组(P<0.01)，但低于PTZ组(P<0.01)；Gh组和Gs组比较，不同浓度的天麻素对TNF-α的表达有影响，高浓度的天麻素可减少TNF-α的表达(P<0.05)。由此推断，天麻素有抑制癫疒间发作的作用，其机制可通过降低海马的TNF-α活性和表达，抑制癫疒间的产生和发展来发挥抗癫疒间的作用。笔者前期研究发现，TNF-α可以通过增加NMDA及其受体的表达，抑制GABA及其受体的表达，从而发挥抗癫疒间的作用。另外，由于p38MAPK通路在炎症反应的上游起着调控作用。其对IL-1β、IL-2、IL-6的表达会产生影响。有报道，在脑组织中，TNF-α可以促进细胞因子的释放，影响癫疒间的发生发展[9]。故本实验中Gh、Gs组中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表达减少。

综上所述，天麻素对癫疒间的抑制作用，主要通过p38MAPK蛋白表达减少促使下游产物降低和其本身的抗炎作用对IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表达的抑制，使IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表达减少，从而达到抑制癫疒间的效果。但天麻素减少p38MAPK蛋白和部分炎性细胞因子的表达的具体机制还有待于进一步探讨。

[1] 吴逊.癫疒间和发作性疾病[M].北京:人民军医出版社,2001:1-2.

[2] 郑慧锋,彭昊.天麻素生物学作用研究进展[J].中国医药,2014,9(11):1726-1728.

[3] 李智平.戊四氮点燃大鼠慢性癫疒间模型的建立及评价[C].第十届全国儿科药学学术会议,2005:94-98.

[4] Paxinos G,Watson C.鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,2005:1.

[5] Gaundar SS,Bendall LJ.The potential and limitations of p38MAPK as a drug target for the treatment of hematological malignancies[J].Curr Drug Targets,2010,11(7):823-833.

[6] Chou IC,Lin WD,Wang CH,et al.Interleukin(IL)-1beta,IL-l receptor antagonist,IL-6,IL-8,IL-10,and tumor necrosis factor alpha gene polymorphisms in patients with febrile seizures[J].J Clin Lab Anal,20l0,24(3):154-159.

[7] 乔莉霞,于苏文.癫疒间患者血浆白介素1β、白介素2的临床分析[J].齐齐哈尔医学院学报,2014,35(4):484-485.

[8] 冯铁为,李敬孝.细胞因子与癫疒间发病机制的研究[J].云南中医中药杂志,2010,31(4):65-67.

[9] 冯基高,王东军.肿瘤坏死因子α在癫疒间中的作用[J].医学综述,2010,16(2):186-188.

Research on antiepileptic mechanism of gastrodin in adjusting inflammatory signal pathway on the hippocampus of epileptic rats

LI Fei,SUN Ya-ling,CHENG Xiang-lin*,CAI Guang-xin,CAI Xin-yu,XU Xiao-ming,ZHU Zhan-sheng

(The Yangtze University Clinical Medical College,The First People’s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China)

Objective To investigate the antiepileptic mechanism of gastrodin in adjusting inflammatory signal pathway on the hippocampus of pentylenetetrazol (PTZ)-induced epileptic rats.Methods40 adult Wistar rats were randomly divided into normal control group (NC),epileptic model group (PTZ),gastrodin high-dose group (Gh) and gastrodin small doses (Gs) group.The changes of behavior and EEG were observed.p38MAPK protein expression was detected by Western blot,the content of IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α in rat hippocampus were detected by ELISA method.ResultsThe levels of seizure degree,EEG changes,p38MAPK protein expression and some inflammatory cytokines IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α in hippocampus of Gh group rats were significantly lower than those of PTZ groups (P<0.01).ConclusionGastrodin can reduce p38MAPK protein expression in hippocampus of epileptic rats,inhibit the secretion of inflammatory cytokines such as IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α,and achieve the antiepileptic effect.

Epilepsy; Pentylenetetrazole; Gastrodin; p38MAPK protein; Cytokines

2014-09-10

长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院，荆州 434000

湖北省卫生厅科研一般项目(JX6B33)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505002

*通信作者