邱波，张卓，申道福，杨雪峰，郑华川，高野康雄，黄克强

（1.辽宁医学院附属第二医院口腔科，辽宁 锦州 121001；2.辽宁医学院附属第一医院口腔科，辽宁 锦州 121001；3.辽宁医学院附属第一医院肿瘤中心，辽宁 锦州 121001；4.日本神奈川癌中心，横滨 241-0815，日本）

头颈部鳞癌中α-catulin表达的临床病理和预后意义

邱波1，张卓2，申道福3，杨雪峰3，郑华川3，高野康雄4，黄克强1

（1.辽宁医学院附属第二医院口腔科，辽宁 锦州 121001；2.辽宁医学院附属第一医院口腔科，辽宁 锦州 121001；3.辽宁医学院附属第一医院肿瘤中心，辽宁 锦州 121001；4.日本神奈川癌中心，横滨 241-0815，日本）

目的细胞骨架连接蛋白α-catulin是Rho信号通路组件之一，在癌细胞凋亡、抗衰老、细胞骨架重组、迁移、侵袭和上皮细胞间质转化（EMT）过程中发挥重要作用。探讨头颈部鳞癌中α-catulin表达的临床病理和预后意义。方法采用免疫组化方法检测α-catulin在头颈部鳞状上皮癌（HNSCC）组织芯片中的表达，分析其和临床病理学特征及生存率的关系。结果αcatulin在HNSCC原发癌中的表达比正常和异型增生的鳞状上皮细胞显著增高（P＜0.05），但是和HNSCC的恶性生物学行为和不良预后无明显相关（P＞0.05）。Cox比例风险回归分析结果显示远处转移和TNM分期是HNSCC的独立预后因素（P＜0.05）。结论上调α-catulin的表达在HNSCC病因学上具有重要意义，可作为研究HNSCC肿瘤发生的分子靶标。

头颈部鳞癌；α-catulin；肿瘤发生；病理生物学行为；预后

头颈部鳞状上皮癌（squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSCC）是常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别占5%和4%， HNSCC常首要转移至颈部淋巴结并导致死亡。由于肿瘤干细胞和上皮-间质转化（EMT）现象的存在，使HNSCC转移和化疗药物抵抗能力增强［1］。α-连环蛋白相关蛋白（α-catulin）是CTNNAL1编码的膜转运蛋白，其过表达可降低E-cadherin并增高N-cadherin、Snail/Slug和MMPs的表达，进而促进黑色素瘤的侵袭和转移［2］。Liang等［3］发现α-catulin可通过与ILK相互作用而促进其下游Akt-NF-κB信号通路激活，使纤连蛋白和整合素αvβ3表达增高而促进肿瘤转移，靶向抑制α-catulin可通过下调NF-κB和MAPK信号通路而提高黑色素瘤细胞对顺铂的化疗敏感性［4］。这些结果提示，α-catulin可能通过参与EMT过程提高癌细胞干细胞属性，进而促进肿瘤演进。本研究中主要研究HNSCC发生过程中α-catulin蛋白表达及其临床病理和预后意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾性研究了1995年1月至2008年12月神奈川癌中心附属医院接受手术和活检的485例头颈部鳞癌患者，所有患者均接受神奈川癌中心基于TNM分期的系统治疗，接受过治疗的HNSCC患者被排除。此外，头颈部157例正常鳞状上皮和152例异型增生病例用于HNSCC比较，48例淋巴结转移灶也收集到本研究中。HNSCC患者平均年龄51.2岁（20～81岁），通过病志阅读和电话咨询进行随访，根据赫尔辛基宣言告知患者或其家属将切除组织进行病理学研究，所有操作规程通过神奈川癌中心和辽宁医学院伦理委员会。

1.2 病理及组织芯片（TMA）构建

所有组织均经10%中性甲醛固定并包埋在石蜡中，制备成4 μm病理切片后苏木精-伊红（HE）染色确定组织学诊断和特征。HNSCC的TNM分期依据国际抗癌联盟标准，组织学结果依据WHO分级系统，肿瘤位置、肿块大小、淋巴结和远处转移等均被确认。

在HE染色切片的指引下，病理医师选择代表性区域，利用直径2 mm穿刺针切取石蜡标本并放入48阵列受体蜡块的点穴中，所有操作均运用芯片机（AZUMAYA KIN-1，日本）进行。

1.3 免疫组化

组织芯片4 μm切片后脱蜡至水，经TRS抗原修复液微波修复15 min，过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，5%BSA封闭非特异性结合位点，鼠抗α-catulin抗体（Abcam，1∶40）孵育15 min，HRP标记抗鼠IgG（DAKO，1∶1 000）二抗孵育15 min，DAB显色后苏木精复染，脱水透明封片，操作规程参照文献［5］中微波间歇性照射免疫组化的步骤进行，不加一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组化结果评价

α-catulin蛋白定位于细胞质或膜上（图1），由2位病理医生随机选取5个视野并计数100个细胞，2者评价结果达到一致为止。α-catulin阳性率分级：0，0%；1，1%～50%；2，50%～74%；3，≥75%；阳性强度分级：1，弱；2，中等；3，强；评分标准=强度×阳性率：-，0；+，1～2；++，3～5；+++，6～9。

1.5 统计学分析

运用Spearman相关分析处理等级资料，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank分析确定生存率差别，Cox风险比率回归模型进行多变量生存分析。SPSS 10.0统计软件分析所有数据，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组化结果表明，α-catulin在原发癌和淋巴结转移癌细胞质和膜上高表达，而在复层扁平上皮和异型增生中呈低表达（图1）。复层扁平上皮、异型增生、原发癌和淋巴结转移癌中α-catulin蛋白阳性表达率分别为11.2%（17/152）、51.8%（251/485）、58.3%（28/48），见表1。根据表达强度和频率，头颈部原发鳞癌与复层扁平上皮和异型增生中α-catulin表达差异有统计学意义（P＜0.05），原发癌和淋巴结转移癌中α-catulin表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

HNSCC恶性生物学行为各组间α-catulin表达差异无统计学意义（P＞0.05，表2），包括性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、肿块大小、淋巴结转移、远处转移和TNM分期。

图1 头颈部鳞上皮、异型增生和鳞癌中α-catulin蛋白的表达Fig.1 α-catulin expression in squamous mucosa，dysplasia and carcinoma of head and neck

表1 头颈部鳞癌发生和发展过程中α-catulin蛋白表达Tab.1 α-catulin expression in carcinogenesis of head and neck squamous cell carcinomas

表2 α-catulin蛋白表达与头颈部鳞癌临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between α-catulin expression and clinicopathological characteristics of head and neck squamous cell carcinomas

本研究随访了381例HNSCC患者，随访时间7～96个月（中位生存时间28.8个月），根据α-catulin蛋白表达绘制HNSCC患者的生存曲线（图2），Kaplan-Meier单变量生存分析显示α-catulin表达缺失组和阳性表达组中HNSCC整体或无病生存率差别无统计学意义（P＞0.05），Cox风险比率回归多变量分析结果显示远处转移和TNM分期是HNSCC整体生存率的独立预后因素（P＜0.05，表3）。

图2 α-catulin蛋白表达与头颈部鳞癌患者预后的关系Fig.2 Correlation between α-catulin expression status and the prognosis of patients with head and neck squamous carcinoma

表3 头颈部鳞癌临床病理特征的多变量生存分析Tab.3 Multivariate analysis of clinicopathological variables for the survival with head and neck squamous cell carcinoma

3 讨论

人类α-catulin基因（CTNNAL1）定位于9q31-32，含有734个氨基酸残基，编码蛋白分子量82 kDa，其N端区域包含β-catenin、talin和α-actinin蛋白结合位点。α-catenin C端同源区两亲性螺旋含有紧密连接蛋白ZO-1和细胞骨架肌动蛋白的潜在结合位点［6，7］。

α-catulin在炎症、细胞凋亡、细胞骨架重建、衰老、癌症进展和EMT中是重要的蛋白。为阐明αcatulin表达的作用，我们对组织芯片进行了免疫组化研究，结果发现从头颈部鳞状上皮-异型增生-鳞癌的演变过程中α-catulin过表达，提示α-catulin表达上调参与头颈部复层扁平上皮细胞恶性转化过程。有文献报道［4，8］，黑色素瘤细胞中a-catulin表达高于黑色素细胞，乳腺癌中CTNNAL1mRNA表达显著高于对应的正常乳腺组织。Fan等［9］发现α-catulin在恶性头颈部鳞癌和小鼠口腔鳞状细胞癌模型中的肿瘤侵袭前沿和转移性细胞中高表达。因此，这些数据表明α-catulin过度表达可能作为HNSCC发生的潜在分子标志。虽然有报道［9］表明α-catulin与肿瘤大小、鳞癌TNM分期呈正相关，但是本研究结果并没有显示α-catulin表达与HNSCC恶性生物学行为有关，原发癌和淋巴结转移癌中α-catulin表达也未见差异。然而，伴有盆腔淋巴结转移的宫颈癌中CTNNAL1 mRNA表达水平高于未伴有淋巴结转移的病例。单因素生存分析显示，α-catulin蛋白表达与其HNSCC患者的整体和无病率无关，多变量分析表明远处转移、TNM分期是HNSCC患者总生存的独立预后因素。以上结果表明，用α-catulin表达作为HNSCC恶性生物学行为和不良预后的分子标志需慎重。

总之，头颈部鳞状上皮-异型增生-鳞癌的发生过程中α-catulin表达上调，提示其过表达参与鳞状上皮恶变过程。此外，α-catulin表达与HNSCC的恶性生物学行为和不良预后无明显相关，远处转移和TNM分期是HNSCC整体生存的独立预后因素。

［1］Satpute PS，Hazarey V，Ahmed R，et al.Cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma：a review［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（10）：5579-5587.

［2］Kreiseder B，Orel L，Bujnow C，et al.α-Catulin downregulates E-cadherin and promotes melanoma progression and invasion［J］.Int J Cancer，2013，132（3）：521-530.

［3］Liang CH，Chiu SY，Hsu IL，et al.α-Catulin drives metastasis by activating ILK and driving an αvβ3 integrin signaling axis［J］.Cancer Res，2013，73（1）：428-438.

［4］Kreiseder B，Holper-Schichl YM，Muellauer B，et al.Alpha-catulin contributes to drug-resistance of melanoma by activating NF-κB and AP-1［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0119402.

［5］Kumada T，Tsuneyama K，Hatta H，et al.Improved 1-h rapid immunostaining method using intermittent microwave irradiation：practicability based on 5 years application in Toyama Medical and Pharmaceutical University Hospital［J］.Mod Pathol，2004，17（9）：1141-1149.

［6］Kreiseder B，Holper-Schichl YM，Muellauer B，et al.Alpha-catulin contributes to drug-resistance of melanoma by activating NF-κB and AP-1［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0119402.

［7］Xiang Y，Qin XQ，Liu HJ，et al.Identification of transcription factors regulating CTNNAL1 expression in human bronchial epithelial cells［J］.PLoS One，2012，7（2）：e31158.

［8］Tkés AM，Szász AM，Juhász E，et al.Expression of tight junction molecules in breast carcinomas analysed by array PCR and immunohistochemistry［J］.Pathol Oncol Res，2012，18（3）：593-606.

［9］Fan LC，Chiang WF，Liang CH，et al.α-Catulin knockdown induces senescence in cancer cells［J］.Oncogene，2011，30（23）：2610-2621.

（编辑 裘孝琦）

The Clinicopathological and Prognostic Significance of α-catulin Expression in Head Neck Squamous Cell Cancers

QIU Bo1，ZHANG Zhuo2，SHEN Dao-fu3，YANG Xue-feng3，ZHENG Hua-chuan3，TAKANO Yasuo4，HUANG Ke-qiang1

（1.Department of Stomatology，The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Department of Stomatology，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；3.Cancer Center，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；4.Kanagawa Cancer Center，Yokohama 241-0815，Japan）

ObjectiveRho signaling component α-catulin，is a cytoskeletal linker protein and plays an important role in apoptotic and senescence resistance，cytoskeletal reorganization，mobility，invasion and epithelial to mesenchymal transition（EMT）of cancer cells.MethodsHere，we examined α-catulin expression in squamous epithelium，dysplasia and cancer of head and neck on tissue microarrays by immunostaining.Its expression was compared with clinicopathological parameters and survival rate of cancers.ResultsIt was found that α-catulin expression level was significantly higher in primary cancers than that in normal squamous epithelium and dysplasia（P＜0.05），but not significantly correlated with aggressive behaviors or adverse prognosis of HNSCC patients（P＞0.05）.Cox′s proportional hazard model indicated that distant metastasis and TNM staging were independent prognostic factors for overall survival of the patients with head and neck squamous carcinoma（HNSCC，P＜0.05）.ConclusionThese findings suggested that up-regulated expression of α-catulin protein may play an important role in the pathogenesis of HNSCC，which might be employed as a potential marker for tumorgenesis of HNSCCs.

head and neck squamous cell carcinoma；α-catulin；pathogenesis；progression；prognosis

R739

A

0258-4646（2015）12-1079-04

国家自然科学基金（81172371；81472544）；辽宁省教育厅优秀人才计划（LJQ2014093）；辽宁省科技计划项目（2015408001）；辽宁省自然科学基金（2015020326）

邱波（1987-），女，医师，硕士.

黄克强，E-mail：hkq9@163.com

2015-05-11

网络出版时间：