周洋，周佳任，徐漫飞，张怡舜，赵岩

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

·论著·

未足月胎膜早破患者外周血中分泌型磷脂酶A2的表达与羊膜腔感染的相关性

周洋，周佳任，徐漫飞，张怡舜，赵岩

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

目的研究外周血中分泌型磷脂酶A2（sPLA2）在未足月胎膜早破及羊膜腔感染中的作用及其意义。方法采用实时荧光定量PCR技术检测30例未足月胎膜早破患者（实验组）分娩发动前后、30例未发生胎膜早破的未足月正常妊娠患者（正常对照组）及30例足月胎膜早破患者（足月对照组）分娩发动后外周血中sPLA2mRNA的表达水平。未足月胎膜早破患者结束妊娠后取胎膜行病理学检查，以确定有无组织学绒毛膜羊膜炎。结果未分娩发动时sPLA2mRNA的表达水平实验组为1.079± 0.746，正常对照组为0.651±0.481，实验组与同孕周正常对照组相比sPLA2mRNA的表达水平升高，差异有统计学意义（P= 0.011）。分娩发动时外周血中sPLA2mRNA的表达水平实验组为2.439±0.086，足月对照组为2.575±0.036，实验组与足月对照组相比sPLA2 mRNA的表达水平无统计学差异（P=0.787）。实验组中分娩发动时sPLA2的含量与是否患绒毛膜羊膜炎有关（P=0.008）。结论sPLA2升高可能参与未足月胎膜早破的发病，并与羊膜腔的感染有关。

胎膜早破；分泌型磷脂酶A2；绒毛膜羊膜炎；分娩发动

分娩的发动是一个极其复杂的生理过程，是受多种因素综合作用的结果。目前国内外有很多证据支持前列腺素在促进子宫收缩及启动人类分娩方面起着核心作用［1］，分泌型磷脂酶A2（secretoryphospholipase A2，sPLA2）作为前列腺合成途径中其中一步的限速酶，被证实在人类妊娠组织中表达。国内现有研究表明早产及足月临产组血清中sPLA2含量均高于对照组，这些结果提示未足月或足月分娩发动时sPLA2表达上调可能是导致前列腺素合成增加的部分原因，并且sPLA2的表达增加可能与自发性胎膜早破有关［2］，但尚缺少相关研究及有力证据。最近的国外研究表明，使用反义寡核苷酸抑制sPLA2的表达及酶活性可以抑制前列腺素合成［3］，这为降低早产的发生率提供了新的治疗技术干预，为预防早产的发生提供了新方向。胎膜早破是导致早产的重要原因之一，其中未足月胎膜早破（孕周小于37周的胎膜早破）对于新生儿围产期患病率及死亡率的影响最大，而发生胎膜早破后是否出现羊膜腔感染对于新生儿及孕妇的预后均具有重要意义。国内现有关sPLA2与未足月胎膜早破及宫内感染相关性的研究较少。因此，本研究通过检测未足月胎膜早破患者外周血中sPLA2 mRNA的水平，探讨其在未足月胎膜早破中的表达及意义，评价高水平sPLA2对诊断未足月胎膜早破后宫内感染的可行性以及其能否作为预测宫内感染的指标，探讨未足月胎膜早破分娩发动的可能机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2014年2月至11月在中国医科大学附属盛京医院产科住院的患者共90例，将30例未足月胎膜早破患者（孕28～36周）编入实验组，将与实验组同期入院的30例未发生胎膜早破的孕28～36周的正常妊娠患者作为正常对照组（与实验组比较孕周无统计学差异，P＞0.05），将30例足月胎膜早破患者（孕37～40周）作为足月对照组。采每位受试对象抗凝外周血5 mL，分离血清。排除标准：既往有高血压、心脏病、肝炎、肾炎、自身免疫性疾病、内分泌疾病等合并症；本次为多胎妊娠、妊娠有先兆流产、妊娠期高血压疾病、糖尿病等产科并发症及有临床感染症状（包括孕妇体温高于37.5℃、母体外周血白细胞≥15×109/L、胎心率＞l60次/min等）。

1.2 仪器设备和试剂

-70℃深低温冰箱（日本SANYO公司）；实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；引物合成由上海Invitrogen公司完成；cDNA反转录试剂盒、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR工具包（日本Takara公司）；TrizolTMRNA隔离试剂（美国Invitrogen公司）。

1.3 实验方法

sPLA2 mRNA的含量使用实时定量PCR法测定，具体步骤如下：（1）-80℃冰箱内取出冻存外周血，加入氯仿、异丙醇，沉淀并纯化RNA，取RNA溶液2 μL，采用紫外分光光度计检测样本的光密度（optical density，OD）值和浓度，A260/A280均在1.8～2.0之间。（2）DNA消化酶Ⅰ处理RNA，去除基因组污染。配制反应液，37℃孵育60 min即得到无DNA的RNA溶液。逆转录反应，配制反应液，37℃反应15 min，4℃反应5 s，以此cDNA为模板进行实时定量PCR或长期保存于-70℃。（3）引物序列：GAPDH正义链5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′，反义链5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′，引物长度18 bp。（4）配制实时PCR反应体系，在PCR仪上扩增，反应条件为94℃预变性5 min、94℃变性5 s、60℃退火30 s，共40个循环。（5）△△Ct法分析结果：采用相对定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表达为内参基因，依据公式△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，分别计算实验组和对照组的△Ct，再依公式△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组，计算出△△Ct值，最后计算相对表达量的差值即2-△△Ct，它表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

在实验组患者结束妊娠后取胎膜行病理学检查。组织学羊膜腔感染的诊断标准：采用HE染色法，绒毛膜板及羊膜上白细胞呈弥散性聚集，每个高倍镜视野有5～10个中性粒细胞浸润，且白细胞浸润呈极性分布。确定有无组织学绒毛膜羊膜炎（histological chorioamnionitis，HCA）。

1.4 统计学分析

所有实验数据用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。实验组和对照组间各计量资料的比较进行独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组与正常对照组外周血中sPLA2 mRNA的表达

实验组在未分娩发动时与正常对照组患者入院时外周血中sPLA2 mRNA含量分别为1.079± 0.746和0.651±0.481。实验组外周血中sPLA2 mRNA含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P=0.011）。

2.2 实验组分娩发动时HCA患者与非HCA患者sPLA2mRNA的表达

入院时HCA患者与非HCA患者比较sPLA2 mRNA水平无统计学差异（P=0.480）。而分娩发动时，HCA患者sPLA2 mRNA水平高于非HCA患者（P=0.008），分娩发动时间HCA患者短于非HCA患者（P=0.020），差异均有统计学意义。见表1。

2.3 实验组与足月对照组分娩发动时sPLA2 mRNA的表达

实验组分娩发动时sPLA2 mRNA的含量（2.439±0.086）与足月对照组（2.575±0.036）比较无统计学差异（P=0.787），提示胎膜早破患者分娩发动时sPLA2表达随着妊娠周数增加无明显差异。

表1 HCA患者与非HCA患者间比较Tab.1 Comparison between HCA and non-HCA patients

3 讨论

3.1 关于sPLA2在未足月胎膜早破发生中的作用

磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一种重要的调节和代谢酶类，广泛存在于哺乳动物的细胞和体液之中，在体内发挥多种生理功能，如膜磷脂的降解和代谢、信号传导、宿主防御、血液凝固、细胞膜重建、二十二烷酸前体生成等。

近年来，各医学学科中sPLA2的作用主要集中在几个方面：（1）肿瘤病变、细胞增殖、血管侵袭和肿瘤转移等方面［7］；（2）与男性生殖相关，如精子获能、顶体反应及受精过程中［8］；（3）与动脉粥样硬化相关，有研究发现它们可以进而促进巨噬细胞和血管平滑肌细胞的泡沫化，促进胶原蛋白的暴露，从而导致动脉粥样斑块的形成和发展［9］。

PLA2可分为分泌型（sPLA2）、胞浆型（cPLA2）、非钙离子依赖型（iPLA2）3种类型［4，5］。近年来有研究表明：sPLA2与cPLA2均被证实在人类妊娠组织中有表达，而且分娩发动时表达上调的是sPLA2［6］，妊娠期sPLA2主要表达在羊膜、绒毛膜、蜕膜或胎盘。

很多证据支持前列腺素在子宫收缩和启动人类分娩机制方面起着重要作用，前列腺素合成大致分为3个阶段，首先由磷脂酶催化膜磷脂生成花生四烯酸，接着由环氧合酶催化花生四烯酸生成前列腺素H2，最后各种特异性前列腺素合成酶催化生成前列腺素E、前列腺素F、前列环素和血栓素。可见前列腺素的合成中，sPLA2是一步极其重要的限速酶。这些结果提示早产或足月产时sPLA2表达上调可能是前列腺素合成增加的部分原因［2］。

本研究中我们发现，实验组在未分娩发动时sPLA2水平即明显高于正常对照组，而实验组中HCA与非HCA患者入院时sPLA2水平无统计学差异，表明入院sPLA2高水平来自于胎膜早破，而不是宫内感染。在国内，有关sPLA2与早产关系的研究较少，现有研究表明早产临产及足月临产组血清磷脂酶A2含量均高于对照组。与研究发现的sPLA2在早产妇女的子宫下段肌层中表达显著升高相符，所以作为重要分娩启动机制的限速酶之一，sPLA2含量的测定可能对早产的预测非常有用［3］。

胎膜早破被认为是发动早产最可能的原因，随着人们对未足月胎膜早破发病机制的不断研究，现胎膜早破的发病机制研究已从单纯的机械力学到感染、从细胞因子到基因水平，其中亚临床宫内感染被认为是胎膜早破发病的主要原因，且与胎膜早破互为因果。胎膜早破多与感染及炎症有关，感染时胎膜局部张力下降，炎症时细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子α升高，可激活溶酶体酶，破坏羊膜组织导致胎膜早破［10］。

本研究表明，未足月胎膜早破患者外周血中sPLA2较同孕周正常妊娠患者升高（P＜0.05），提示胎膜早破的发生可能与sPLA2含量的增高有一定关系。sPLA2含量升高，使IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、肿瘤坏死因子α、γ干扰素等炎性因子分泌增加，引起一系列炎性反应，导致胎膜胶原加速降解，胎膜强度及韧性均有所下降，进而导致胎膜破裂。最近的国外研究表明：使用反义寡核苷酸抑制sPLA2的表达及酶活性可以抑制前列腺素合成［3］，这对降低早产的发生率提供了新的治疗技术干预，对预防早产的发生提供了新方向。

3.2 未足月胎膜早破与羊膜腔内感染

早产是围产医学中的一个重要、复杂而又常见的妊娠并发症。目前，早期婴儿的死亡率中75%与早产有关，死于新生儿期者15%为早产儿，尚有8%的早产儿虽然存活，但可遗留下智力障碍或神经系统相关后遗症［11］。其中未足月胎膜早破是造成极低及超低出生体质量儿的常见产科因素，并对新生儿围产期总死亡率的升高贡献达到了近20%［12］。所以，发生未足月胎膜早破后延长孕周，从而增加胎儿的成熟度，减少死亡率，同时避免宫内感染成为了产科医生保守治疗的目标，同时也是临床工作中遇到的一大挑战。一旦发现宫内感染，则应该尽快终止妊娠，减少新生儿感染等不良后果发生的可能性。但目前临床上尚无一种令人满意的实验室检查可以在早期发现或诊断宫内感染。目前临床上常用的生物指标包括红细胞沉降率、白细胞计数及C反应蛋白测定等。其中，临床上最常用的是外周血白细胞计数及C反应蛋白水平。

白细胞计数升高是严重的全身性感染的临床金标准，但其为非特异性，通常白细胞计数≥15× 109/L可早期辅助诊断HCA，但其在宫内感染早期诊断中的意义不大［13，14］。

C反应蛋白是一种随着急性炎症出现而升高的急性期反应蛋白。结合C反应蛋白随时间的增长速度，可明显增加其诊断细菌感染的精确性，所以作为一种标记物，C反应蛋白被广泛用于感染、炎症及恶性肿瘤的诊断。目前在产科临床上，C反应蛋白经常被用作无明显症状的宫内感染的诊断以及未足月胎膜早破后保胎过程中的宫内感染监测指标。当C反应蛋白≥2 mg/dL，或入院后每天浓度变异≥30%，则可协助HCA的诊断；C反应蛋白在临界值，其百分变异系数＞15%（相隔6 h连续测定）应怀疑HCA感染。

由此可见，在实验组分娩发动时与未伴随HCA的实验对象比较，伴随HCA的实验对象sPLA2表达升高，这提示了sPLA2的表达高低与HCA的发生具有一定关系。sPLA2的高表达可能在一定程度上启动相关炎性反应的发生，进而从某一方面促成HCA的发生。另一方面，本实验中sPLA2高表达者发动产程的时间明显缩短（P=0.02），进一步说明sPLA2可能是加速分娩进程的重要因素之一。

3.3 sPLA2与妊娠周数的关系

本研究中，在实验组及足月对照组分娩发动时，比较sPLA2的表达无明显差异（P=0.787），这一结果的产生可能是因为本实验入选实验组及对照组的观察例数较少，存在一定偏差。如扩大实验的范围或例数，也许能得出不一样的结论。就本研究而言，胎膜早破分娩发动时sPLA2的表达高低与妊娠周数无明显关系。

综上所述，sPLA2的升高可能参与未足月胎膜早破的发病，同时其表达的高低从某种程度上促成了组织学HCA的发生。如对其深入研究，将有助于进一步阐明胎膜早破的发生机制，为预防胎膜早破、羊膜腔感染及早产提供新思路，为减少新生儿感染等不良后果的发生开辟新途径。

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（编辑陈姜）

Correlation of Expression of Secretory Phospholipase A2 in Peripheral Blood and Infection of Amniotic Cavity in Preterm Premature Rupture of Membranes

ZHOU Yang，ZHOU Jia-ren，XU Man-fei，ZHANG Yi-shun，ZHAO Yan

（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To explore the role and significance of secretory phospholipase A2（sPLA2）in peripheral blood in preterm premature rupture of membranes（pPROM）and infection of amniotic cavity.MethodsRT-PCR was used to detect the expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood of 30 patients with pPROM（experimental group），30 non-full term normal pregnant patients without pPROM（normal control group）and 30 full term patients with PROM（full-term control group）before and after delivery.Fetal membranes were collected at the time of delivery of patients with pPROM for pathologic examination to determine histological chorioamnionitis（HCA）.ResultsThe expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood were 1.079±0.746 and 0.651±0.481 in the experimental group and the normal control group before delivery，respectively，indicating that the expression of sPLA2 mRNA was increased in the experimental group compared with the normal control group（P=0.011）.The expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood were 2.439±0.086 and 2.575±0.036 in the experimental group and the full-term control group at labor onset，respectively，indicating that there was no statistically significant difference in the level of sPLA2 mRNA in peripheral blood between the experimental group and the full-term control group at labor onset（P=0.787）.The level of sPLA2was related to chorioamnionitis in the experimental group at labor onset.ConclusionThe increase of sPLA2may participate in the pathogenesis of preterm premature rupture of membranes and is related with the infection of chorioamnionitis.

premature rupture of membranes；secretory phospholipase A2；chorioamnionitis；labor onset

R714.21

A

0258-4646（2015）06-0520-04

周洋（1988-），女，硕士研究生.

赵岩，E-mail：zhaoy@sj-hospital.org

2015-01-03

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