姜红刘广志周建华杨亭亭向雅娟敖冬慧高旭光

·短著述·

多发性硬化抗原特异性调节性T细胞的免疫活性☆

姜红*刘广志*周建华△杨亭亭*向雅娟*敖冬慧*高旭光*

多发性硬化CD4+CD25+调节性T细胞白介素转化生长因子

多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种发生于中枢神经系统的炎性脱髓鞘疾病，致残率很高，严重影响患者的生存质量[1]。其发病机制迄今尚未完全明确，多认为由于基因和环境的相互作用有关[2]。多个研究发现MS患者外周血CD4+CD25highTreg的效应功能较正常对照下降[3]。动物实验中，经静脉注射给予EAE鼠CD4+CD25+Treg可明显缓解其临床病情[4]。获取足量功能改善的Treg并自体回输无疑会为MS治疗提供一个安全有效新途径。

既往我们通过体外诱导的方法，以髓鞘碱性蛋白（MBP）85-99肽段作为抗原，以同种异体CD40配体激活的B细胞为APC，和患者的CD4+CD25-细胞共培养，并以髓鞘碱性蛋白（MBP）85-99、可溶性4-1BBL、雷帕霉素共刺激10 d，在体外诱导出功能正常的Treg[5]，但其机制尚未明确。因此本文检测了体外诱导的Treg和CD4+CD25-T细胞共培养的上清液中IL-10(白细胞介素-10)和TGF-β1（转化生长因子-β1）的表达，以期对Treg的功能抑制机制作进一步的探讨。

1 对象与方法

1.1 病例收集设MS组（n=5）和健康对照组（n=5），全部为北方汉族人，均经SSP-PCR方法进行HLA-DRBl基因分型后证实为DR2+。MS入组标准:①患者知情同意；②所有MS患者符合2005年McDonald年诊断标准[6]，且均为病情稳定的复发-缓解型MS。排除标准：①入组前6个月内曾接受免疫调节药物治疗；②合并有其他自身免疫性疾病。健康对照经检查均排除神经系统疾病和其他自身免疫病。B细胞由同种异体的健康志愿者外周血分离。

1.2 B细胞的磁珠分选、体外培养人CD4+初始T细胞的磁珠分选及鉴定使用B细胞的磁珠分离试剂盒和CD4+初始T细胞的磁珠分离试剂盒进行，具体操作步骤见[5]。

1.3 人MBP85-99特异性Treg的诱导、扩增及分选将MS患者及健康对照CD4+初始T细胞与同种异体B细胞混合，加入MBP85-99肽段（0.2µg/mL）、可溶性4-1BBL（0.2µg/mL）、雷帕霉素（109 nmol/L）培养10 d，加入抗人CD4（Percp）、CD25(APC)、CD127(FITC)单抗送北京大学医学部流式细胞进行分选Treg细胞。具体操作步骤见[5]。

1.4 混合淋巴细胞培养使用淋巴细胞分离液常规分离MS患者及对照新鲜外周血中单个核细胞，每108个细胞加入20µL抗人CD4 PerCP、CD25APC McAb各20µL，送北京大学医学部中心实验室进行流式分选CD4+CD25-T细胞。将分选所获Treg（2x104个/孔）与自体CFSE标记的CD4+CD25-T细胞按1:1比例共培养，同时加入经钴60（30Gray）照射的自体PBMC 1x105个/孔,加入含有10%FBS的RP⁃MI 1640培养液150µL进行培养。病例组和对照组均分为3个亚组：①阴性对照：CD4+CD25-T细胞+PBMC+Treg；②MBP组：CD4+CD25-T细胞+PBMC+Treg+MBP85-99肽段；③阳性对照：CD4+CD25-T细胞+PBMC+Treg+抗-CD3和抗-CD28 McAb,3 d后收集细胞，取上清液用以检测上清液中IL-10和TGF-β1的表达。由于病例组和对照组各有1例在培养中出现污染，最终病例组及对照组均只得到4例的检测结果。

1.5 ELISA法检测培养上清IL-10和TGF-β1的表达使用ELISA试剂盒检测检测培养上清里IL-10和TGF-β1的表达，具体操作严格按照试剂盒步骤进行。所有标准品和样本均复空加样，取均值进行分析。根据标准品均值数值绘制标准曲线，根据标准曲线计算各组样本浓度。

1.6 统计学方法数据先进行方差齐性检验，符合正态分布的数据分析分别采用单因素方差分析和T检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 培养上清中IL-10的含量根据标准品均数绘制标准曲线，如图1所示，计算得到标准曲线，y=38.01x-1.872。根据标准曲线计算样品浓度，MS组中各亚组IL-10的平均浓度分别为：阴性对照组（1.58±0.09）pg/mL，MBP组为（2.32±0.12）pg/mL，阳性对照组为（1.63±0.08）pg/mL。健康对照组中各亚组IL-10的平均浓度分别为：阴性对照组

(1.62±0.12)pg/mL，MBP组为（2.26±0.08）pg/mL，阳性对照组为（1.62±0.11）pg/mL。MS组和健康对照组中各亚组比较：阴性对照组和MBP组比较、阳性对照组和MBP组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 培养上清中TGF-β1的含量根据标准品均数绘制标准曲线，如图2所示，计算得到标准曲线，y=755.1x+ 89.89。根据标准曲线计算样品浓度，MS组中各亚组TGF-β1的平均浓度分别为：阴性对照组(168±23)pg/mL，MBP组为（267±49）pg/mL，阳性对照组为（181±25）pg/mL。健康对照组中各亚组TGF-β1的平均浓度分别为：阴性对照组（160±37）pg/mL，MBP组为（249±30）pg/mL，阳性对照组为（171±30）pg/mL。MS组和健康对照组中各亚组比较：阴性对照组和MBP组比较、阳性对照组和MBP组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

我们的研究发现，以髓鞘碱性蛋白（MBP）85-99肽段作为抗原，以同种异体CD40配体激活的B细胞为APC，与初始T细胞共培养，并以MBP85-99、可溶性4-1BBL、雷帕霉素共刺激10 d所诱导的Treg在与CD4+CD25-T细胞共培养时均可分泌IL-10和TGF-β1，且病例组和对照组之间无显著差异，结合我们既往的细胞增殖实验的结果[5]，进一步说明病例组和对照组所诱导的Treg具有类似的免疫抑制功能，并且通过分泌IL-10和TGF-β1实现。

图1 IL-10标准曲线

图2 TGF-β1的标准曲线

TGF-β和IL-10是CD4+CD25+Treg所分泌的主要细胞因子。TGF-β有6种亚型，其中TGF-β1占90%以上。本研究发现，无论是病例组还是对照组，各亚组中MBP组TGF-β 1和IL-10的浓度均明显高于其他亚组，说明该诱导的Treg确为抗原特异性Treg。尽管如此，在以往所作的增殖分析中，MBP亚组的增殖抑制能力仅较其他亚组略强[5]，究其原因可能与Treg的其他作用机制有关。现多认为在抗原浓度低时，CD4+CD25+Treg细胞通过细胞接触发挥作用，而在抗原浓度高时该细胞同时通过分泌IL-10和TGF-β等细胞因子发挥免疫调节作用。Treg亦可表达CTLA，CTLA和效应T细胞表面的B7结合传递抑制信号，抑制T细胞的活化与增殖[7]。对此今后应对诱导后Treg上CTLA表达的检测以明确此点。

Jun等[8]发现，给予实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠尾静脉注入Treg可减轻病情严重程度，而使用TGF-β抗体中和TGF-β后，Treg的保护作用则丧失。Ma等[9]研究发现，在猕猴EAE中，总CD4+CD25+Treg和分泌IL-10的I型Treg的数量和抑制功能在急性期显著下降，IL-10水平在急性期急剧下降达9倍之多。醋酸格拉默（GA）是复发RRMS治疗中的一线用药，其作用机制还不清楚。将GA和Treg体外共培养发现，GA可明显增加Treg分泌IL-10的水平[10]。以上研究表明，TGF-β和IL-10对MS具有重要的缓解作用，由于我们所诱导的Treg也可分泌一定水平的TGF-β和IL-10，故给MS患者输入该细胞即相当于增加了外源性TGF-β和IL-10，可能对MS具有一定的治疗作用。

目前，Treg已报道用于I型糖尿病[11]和移植物抗宿主病[12]的治疗。上述治疗中，Treg均显示出良好的疗效和安全性，但是机制还不清楚。我们的研究发现，多发性硬化病人体外诱导的Treg细胞未存在功能缺陷，且可以通过分泌IL-10和TGF-β1来实现抑制功能。但是，IL-10和TGF-β1只是Treg发挥抑制功能的一条途径，对Treg发挥抑制功能的其他机制如接触抑制、CD39和CD73的表达等方面还需要进一步研究，才能更好地将体外诱导的抗原特异性Treg用于临床治疗。讨论内容没有着重突出本研究的新意。

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R744.51(

2014-07-09）

A（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.012

☆ 国家自然科学基金（编号:81171123）

* 北京大学人民医院神经内科（北京 100044）

△北京大学人民医院中心实验室