丁乔廖松洁阙嘉丽李晨光余剑

·论 著·

Netrin-1促进氧糖剥夺后脑微血管内皮细胞存活☆

丁乔*廖松洁*阙嘉丽*李晨光*余剑*

目的通过建立体外氧糖剥夺模型模拟缺血缺氧环境，观察轴突导向因子netrin-1对脑微血管内皮细胞氧糖剥夺损伤后的作用。方法体外培养脑微血管内皮细胞，免疫荧光法检测其netrin-1受体结直肠癌缺失基因（deleted in colorectal cancer,DCC）及uncoordinated(UNC)5H2的表达；并使用不同浓度netrin-1作用于氧糖剥夺损伤的脑微血管内皮细胞，Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒及Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测其细胞活性。结果脑微血管内皮细胞表达UNC5H2受体，无DCC受体表达；与对照组相比，浓度为10、50、100 ng/mL的netrin-1作用于氧糖剥夺损伤的脑微血管内皮细胞后细胞活性增强（10 ng/mL:1.25±0.20,存活率63.33%，P＜0.05;50 ng/mL:1.41±0.17，存活率79.40%，P＜0.05;100 ng/mL:1.33±0.27,存活率75.98%，P＜0.05），且在其浓度为50 ng/mL时细胞活性最强。结论Netrin-1对氧糖剥夺损伤的脑微血管内皮细胞具有剂量相关的保护作用，这种保护作用可能由其受体UNC5H2介导。

netrin-1氧糖剥夺 血管再生

血管再生是指在已存在的微血管基础上新生毛细血管通过内皮细胞出芽的过程[1-2]，已有研究表明在脑梗死等中枢损害后通过促进血管再生有助于改善神经功能[3-4]。Netrin-1是netrins家族中最受关注的一种轴突导向因子，在胚胎期神经系统的发育中，它依赖其受体UNC5H及DCC通过化学性吸引或排斥发挥引导细胞与轴突迁移的作用[5]。目前越来越多的研究者致力于阐明其在血管再生中的作用[6]，然而，netrin-1对血管再生的作用目前还存在争议[7]，这可能与局部netrin-1浓度及内皮细胞表达的netrin-1受体种类有关。本实验拟选用与缺血性卒中密切相关的脑微血管内皮细胞，通过建立体外氧糖剥夺[8]模型模拟缺血缺氧环境，探讨不同浓度的netrin-1对氧糖剥夺损伤后脑微血管内皮细胞的作用，并初步探索何种受体参与调节。

1 材料与方法

1.1 脑微血管内皮细胞的培养大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvessel endothelial cells,RBM⁃VECs）购自美国cell applications公司，培养于含10%胎牛血清的DMEM低糖培养液中，置于CO2培养箱（37°C，5%CO2）培养，每2～3 d换液1次，80%满瓶时传代，取对数生长期细胞分组进行实验。

1.2 RBMVEC的鉴定及RBMVEC上netrin-1受体UNC5H2、DCC的检测采用VIII因子相关抗原（von Willebrand factor protein,VWF）鉴定RBM⁃VEC并检测其上UNC5H2、DCC受体的表达。RB⁃MVEC接种于6孔板，待细胞贴壁后去除培养液，用预热至37°C的0.01 MPBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤后，用0.3%TritonX-100破膜10 min，PBS洗涤后，加入正常山羊血清室温封闭30 min，PBS洗涤后加入兔抗大鼠VWF（1: 200，Santa Cruz），UNC5H2（1：200，Santa Cruz），

DCC（1:1000，Abcam），同时用0.01MPBS代替一抗作为阴性对照，湿盒中4°C孵育过夜，PBS洗涤3次后加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔荧光二抗（1：1000，CST），室温避光孵育1 h，PBS洗涤3次后用1×hochest 33258避光染核10 min，PBS洗涤2次后于倒置荧光显微镜下观察。

1.3 氧糖剥夺模型的建立正常培养的脑微血管内皮细胞去除培养基，加入DMEM无糖培养液，37°C以4 L/min的流速充以95%N2/5%CO2混合气体30 min以创建一个缺氧环境，维持1 h，正常组细胞不做任何处理。

1.4 CCK-8试剂盒检测细胞活性RBMVEC接种于96孔板中，每孔种10000个细胞，设5个复孔，培养24 h细胞贴壁后分别加入含netrin-1 10、50、100 ng/mL的DMEM无糖培养基，阴性对照组仅加DMEM无糖培养基，置于培养箱中孵育2 h后将细胞置于缺氧环境，维持1 h，加入CCK-8，37°C孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长下比色，计算相对吸光度（A）值，实验重复3次。

1.5 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测细胞活性RBMVEC接种于6孔板，待细胞生长至80%时同上述处理，阴性对照组仅加DMEM无糖培养基，置于培养箱中孵育2 h后将细胞置于缺氧环境，维持1 h，用PBS洗涤2次，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，收集细胞沉淀，用PBS洗涤细胞沉淀2次，加入1×Annexin V-FITC结合液300 μL重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC及PI各3 μL，室温下避光孵育15 min，用流式细胞仪检测。

1.6 统计学分析方法采用SPSS13.0进行统计学分析，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），2组比较采用Dunnett检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫荧光正常培养条件下，VWF阳性表明是脑微血管内皮细胞，绿色荧光标记的VWF、UNC5H2蛋白表达于细胞膜，无DCC表达，蓝色为细胞核（见图1、2）。

2.2 CCK-8测细胞活性结果与仅加培养基的阴性对照组相比，氧糖剥夺（oxygen glucose depriva⁃tion,OGD）环境下RBMVEC在培养基中netrin-1浓度为10、50、100 ng/mL时细胞活性增强，吸光度分别为1.25±0.20（P＜0.05）、1.41±0.17（P＜0.05）、1.33±0.27（P＜0.05）,其中netrin-1浓度为50 ng/mL时作用最强（P＜0.05）（如图3）。

2.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测细胞活性与仅加培养基的阴性对照组相比，OGD环境下RBMVEC均在培养基中netrin-1浓度为10、50、100 ng/mL时细胞活性增强（存活率分别为63.33%、79.40%、75.98%，P＜0.05），其中netrin-1浓度为50 ng/mL时作用最强（P＜0.05）（图4）。

图1 用VWF鉴定RBMVEC A：绿色荧光标记的VWF蛋白(箭头示)B：细胞核C：融合后。标尺=200 μm

图2 正常RBMVEC表达UNC5H2情况 A：绿色荧光标记的UNC5H2蛋白(箭头示)B：细胞核C：融合后。标尺=200 μm

图3 CCK-8试剂盒检测细胞活性吸光度值 *与阴性对照组比较，P＜0.05

图4 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测细胞活性 (A:阴性对照组；B:Netrin-1 10 ng/mL；C:Netrin-1 50 ng/mL；D:Netrin-1 100 ng/mL）

3 讨论

本研究发现不同浓度netrin-1作用于氧糖剥夺损伤的脑微血管内皮细胞后细胞活性增强，浓度为50 ng/mL时细胞活性最强，提示netrin-1对氧糖剥夺损伤的脑微血管内皮细胞的剂量相关的保护作用，这种保护作用可能由其受体UNC5H2介导。

我们在先前的研究中发现依赖配体netrin-1的条件性促凋亡受体UNC5H2在脑缺血后远隔丘脑部位呈优势表达[9]，外源性netrin-1蛋白可减轻该部位的细胞凋亡，并改善神经功能，提示netrin-1/ UNC5H2参与脑缺血后的神经可塑性过程[10]。Ne⁃trin-1已被证实参与血管再生，但目前的研究结论并不一致[7]。netrin-1刺激血管内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成，还可促进血管内皮细胞与血管平滑肌细胞之间的粘附，增强血管对内皮生长因子的反应，进而刺激血管再生，因此有研究者提出netrin-1是一种血管生长因子[11-14]。然而，另有研究表明，netrin-1具有抑制血管生成作用，且此过程必须有UNC5H2受体的参与[15-16]。也有研究提出netrin-1的浓度可能与血管再生有关，低剂量时促进血管再生，高剂量时抑制血管再生[17]。这些研究的不同结论可能与其实验条件、netrin-1的剂量及netrin-1受体的表达均有关系。在本研究条件下，我们发现netrin-1对氧糖剥夺损伤的脑微血管内皮细胞具有剂量相关的保护作用，且以50 ng/ mL作用最强。

Netrin-1通过何种受体参与血管再生仍不明确，Wilson等[13]在netrin-1刺激血管内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成的过程中并未检测到受体UNC5H2、DCC、neogenin的大量表达，提示该过程并不依赖于netrin-1的受体；Andrew Nguyen[14]则证实netrin-1通过依赖受体DCC的ERK1/2-eNOS前馈机制增加内皮细胞NO量进而诱导血管再生。而Lu、Larrivee等[15-16]却得出通过受体UNC5H2介导的抑制血管生成作用的结论。本研究仅检测到脑微血管内皮细胞上有UNC5H2的表达，而无DCC表达，提示UNC5H2可能参与netrin-1对氧糖剥夺后脑微血管内皮细胞的保护作用，这还需要进一步验证。

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R743.3

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2014-09-01）

（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.008

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* 中山大学附属第一医院神经科（广州 510080）