吴斌 吴铿

2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，临床表现包括口渴、多饮、多食、多尿、消瘦等，主要是由于胰岛素分泌和/或作用缺陷所引起。T2DM的发展是多因素、多基因参与的过程，其致病机制复杂，包括遗传因素和环境因素，现有的诊断标准并不能从遗传学的角度解释病因及发病机制，难以从基因的整体表达谱全面地观察2型糖尿病发病时基因的反应模式，并且具有一定的滞后性，因而研究起来费时、费力、进度缓慢。然而，越来越多的研究表明，遗传因素在T2DM的发病过程中占据更为主要的地位，全基因组关联分析（Genome-wide association study，GWAS）证实，T2DM有众多的遗传易感基因[1-2]。因此，基因诊断就显得尤为重要，从基因角度分析2型糖尿病，对2型糖尿病的诊治将会提供更多的帮助。本文就基因诊断在2型糖尿病中的研究进展作一综述。

1 基因诊断的研究现状

1.1 基因诊断概述 基因诊断是一项在重组DNA技术的基础上发展起来的应用技术，其检测原理是对受检者的某一特定基因（DNA）和/或其转录物（RNA）进行分析和检测，进而对相应的疾病做出诊断，从基因水平阐明疾病的病因所在。目前，基因诊断技术已经广泛的被应用于诸多领域[3]。基于不同的检测内容，基因诊断可以分为DNA诊断和RNA诊断两部分。前者主要分析基因的结构如DNA序列的缺失、插入、点突变等；后者侧重分析基因的功能，如mRNA量的变化、外显子变异以及间接加工缺陷等。按照检测策略，基因诊断也可以分为两大类：一类为直接基因诊断，指直接对致病基因本身进行检查。通常应用基因本身或邻近的DNA序列作为探针，也可以利用PCR扩增产物进行基因探查，以检测有无点突变、缺失等异常并且判断其性质；另一类为间接基因诊断，主要用于当基因结构不清、复杂或突变过多而导致无法一一检测时，对被检者及其家系进行遗传连锁分析，通过鉴定遗传标记的存在，进而确定患者是否获得带有致病基因的染色体[4]。

1.2 基因诊断的研究技术及相关技术 （1）Southern blot和Nouthern blot：检测特定的DNA、RNA主要的核酸杂交技术有Southern blot和Nouthern blot，该技术主要有3个步骤：核酸的分离与纯化、探针的制备和分子杂交。（2）聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） 及 相 关 技 术：PCR是 一 种对指定的DNA片段在体外进行快速扩增的技术方法。在PCR基础上，进一步发展了包括多重PCR（multiplex PCR）、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、单链构象多态性PCR（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、 序 列 特 异 引 物PCR（Sequence Specific Primer，PCR-SSP）、 逆 转 录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）等。（3）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：RFLP是第一代DNA分子标记技术，被用于基因组遗传图谱的构建、基因的定位以及生物进化和分类等众多领域的研究。利用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时，可获得不同长度、大小、数量的限制性酶切片段，再将这些片段电泳、转膜、变性，并且与标记过的探针进行杂交、洗膜，便可分析其多态性结果。（4）变性高效液相色谱分析（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）：DHPLC是一项新的杂合双链突变检测技术，能自动检测单碱基替代以及小片段核苷酸的插入或缺失，可检测基因的变异情况。（5）基因芯片技术：基因芯片是通过微量点样技术等方法，对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析，从而对基因序列及其功能进行大规模高通量的研究，迅速而准确的解读遗传信息。（6）新一代基因测序技术：新一代基因测序技术是一种和基因芯片技术互相补充的新的高通量测序方法，通常是指一个技术群，不同的新一代基因测序技术，在原理上存在较大的差别。主要包括：全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）、全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing，WES）和目标区域测序（Targeted Regions Sequencing，TRS）等。（7）荧光原位杂交技术（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）：FISH是一种重要的非放射性原位杂交技术，利用非放射性物质（如生物素、地高辛）标记探针，按照碱基配对原则进行杂交，借助荧光素偶联的抗原抗体检测系统，在镜下对组织、细胞及染色体DNA或RNA进行定性、定量或相对定位分析。

2 2型糖尿病基因诊断的研究进展

2.1 单基因突变型糖尿病 单基因突变型糖尿病约占所有糖尿病患者的2%~5%，这种类型糖尿病的外显率（即某人携带突变基因并发展成糖尿病的可能性）很高，为研究其发病机制提供了重要线索。（1）青少年发病的成人型糖尿病（Maturity-Onset Diabetes of the Young，MODY）：MODY是单基因突变型糖尿病首先发现的类型，是一组遗传异质性的临床疾病，其共同特征包括存在非酮症糖尿病、常染色体显性遗传模式、胰岛β细胞功能缺陷。根据突变基因可分为MODY1（HNF4A）、MODY2（GCK）、MODY3（TCF1）、MODY4（IPF1）、MODY5（TCF2）、MODY6（NeuroD1）、MODY7（KLF11）、MODY8（CEL），此外还包括由酶参与底物代谢所引起的突变型MODY及转录因子型MODY[5]。（2）线粒体糖尿病（Mitochondrial Diabetes）：线粒体糖尿病是母系遗传性糖尿病，常伴有轻中度神经性耳聋，常由编码亮氨酸的tRNA的A3243G点突变引起。研究发现，线粒体基因突变可导致胰岛素的利用障碍[6-7]。（3）脂肪萎缩性糖尿病：脂肪萎缩性糖尿病常与缺乏或缺少脂肪组织、重度胰岛素抵抗、高脂血症、脂肪肝等有关。脂肪萎缩性糖尿病有若干类型。其中，部分脂肪萎缩类型是由核纤层蛋白基因A/C（LMNA）突变引起的一种常染色体为主要形式的遗传病。这类患者通常有过多的脂肪堆积在颜面和上半身，然而在躯干和下肢的脂肪含量却逐渐减少。另外，小鼠胸腺瘤癌基因（AKT2）的突变参与了胰岛素信号转导，锌金属蛋白酶（ZMPSTE24）参与了脂肪萎缩的过程，也被认为引起部分脂肪萎缩性糖尿病的原因之一[8]。（4）过氧化物酶体增生物激活受体（PPARγ）基因突变：PPARγ是核受体的PPAR的一种亚型。它是调控脂质、葡萄糖稳态和细胞分化的重要转录因子，在脂肪组织中高度表达，也在胰岛β细胞中表达。其与配体结合后和维甲酸X受体形成异源二聚体，结合特定的DNA，起到转录调控作用。PPARG基因突变可导致常染色体显性脂肪萎缩综合征并伴有早期糖尿病的症状。例如，Barroso与其同事在对重度胰岛素抵抗和早期糖尿病的研究中，发现并报道了两个显性负突变基因（p467l和v290m），其突变体具有降低转录并抑制野生型PPARγ的作用。在对加拿大的一个患有家族性脂肪代谢障碍的家族的研究中发现，位于PPARγ配体结合域的杂合基因P388L存在突变[9-12]。

2.2 多基因突变型糖尿病 与单基因突变型糖尿病相比，多基因突变型糖尿病更为常见，过去的二三十年中，笔者在鉴定2型糖尿病基因突变的领域中付诸了巨大努力。候选基因分析法在三种基因（PPARG，KCNJ11，WFS1）中成功鉴定出增加2型糖尿病风险的常见变异位点。全基因组连锁分析在多个患有2型糖尿病的家族中鉴定出CAPN10和TCF7L2等基因。近期，全基因组关联分析法（GWAS）对大量的单核苷酸多态性进行基因分型，成功鉴定出更多的与2型糖尿病相关的基因或染色体位点。目前，GWAS已成功鉴定出14个基因或位点，这些基因或位点的序列变异在人群中很常见，并且每个基因或位点变异都可增加2型糖尿病的患病风险。

2.2.1 候选基因关联分析法 目前已研究出上百个候选基因，其中可高度复制的候选基因有以下几种。（1）内向整流钾通道亚家族11（KCNJ11）：ATP敏感性钾通道（KATP）在胰岛β细胞表达并且是调节胰岛素分泌的关键因子。它由一个内向整流钾通道Kir 6.2与磺酰脲类受体（由ABCC8编码）组成，Kir 6.2是染色体11p15.1上的KCNJ11基因编码，KCNJ11突变属罕见的激活突变。谷氨酸（E）的一个常见的错义突变ABCC8取代赖氨酸（K）的23位点即（E23K）常被认为与2型糖尿病有关。有证据显示，携带K23基因的患者有很大的可能性对磺脲类药物产生继发性失效[10-11]。（2）过氧化物酶体增生物激活受体（PPARγ）：PPARG的一个常见变异是脯氨酸被丙氨酸在12密码子位点替换（P12A），丙氨酸的等位基因频率在白种人中很高（0.11-0.19），而在非洲裔美国人中却相对较低（0.02）。有研究表明，PPARG的丙氨酸12位点与降低2型糖尿病风险有关，而脯氨酸12位点增加了胰岛素抵抗及2型糖尿病的风险[12]。（3）其他候选基因：WFS1突变导致的Wolfarin氏综合征，可引起尿崩症、糖尿病、视神经萎缩和耳聋；HNF4A突变可引起MODY1等。

2.2.2 全基因组连锁分析法 （1）转录因子7类似物2（TCF7L2）：利用全基因组连锁分析法精细定位标记后，发现在染色体10q25上，TCF7L2的四核苷酸DG10S478与T2DM的发生密切相关，其中TCF7L2是T细胞转录因子家族的成员之一。进一步的研究发现位于内含子3上的rs7903146是一个高度可复制的变异位点，rs7903146等位基因增加了约1.4倍的2型糖尿病患病风险，同时，TCF7L2在信号通路（WNT）中发挥重要作用，参与调节细胞的增殖和变异，在肠内分泌细胞，信号通路通过TCF7L2影响胰高素血糖样肽-1（GLP-1）的分泌[13]。（2）钙蛋白酶10（CAPN10）：通过全基因组连锁分析法，在CAPN10上鉴定出3个常见的可增加2型糖尿病患病风险的变异位点。CAPN10编码钙调节的半胱氨酸蛋白酶，并在多个组织广泛表达。有研究证实，该基因上的变异与2型糖尿病有关。然而，CAPN10是如何影响2型糖尿病的患病风险还不得而知，但鉴于此酶的广泛表达，其可能是通过影响胰岛素抵抗和胰岛素分泌发挥作用[14]。

2.2.3 全基因组关联分析法（GWAS） Sladek和同事首次报道了一个存在于染色体8q24.11上的基因SLC30A8，其可增加2型糖尿病患病风险，还可编码锌转运体8（ZNT8），而ZTN8主要表达于胰岛β细胞，这一发现随后也在其他的GWAS研究中被证实[15]。GWAS研究证实，葡萄糖激酶调节蛋白基因GCKR与空腹血清甘油三酯水平有关，位于GCKR上的一个突变基因P336L与甘油三酯水平、降低空腹血糖水平及降低2型糖尿病患病风险有关。有研究表明，位于染色体3q27的胰岛素样生长因子2结合蛋白2（IGF2BP2）的基因突变与2型糖尿病有关，可增加2型糖尿病的患病风险[16]。FTO是一个与脂肪量和肥胖相关的基因，位于染色体16q12，其在2型糖尿病患病风险方面的作用基于身体质量指数的高低[17]。最近，GWAS研究鉴定出一个新的亚洲人口的2型糖尿病易感基因KCNQ1，位于染色体11p15.5，主要表达于心脏，少量表达在其他组织如胰腺、肝脏和脂肪组织等，其在增加2型糖尿病的风险的同时还可引起长QT间期综合征[18]。其他一些GWAS研究也分别证实了一些与2型糖尿病有关的基因，包括CDKAL1、CDKN2A、CDKN2B、HHEX、KIF11、IDE 等[19-20]。

3 讨论

自从1993以来，笔者对于糖尿病的遗传基础的认识有了显著进步，一些在人群中相对罕见的包含突变点的基因，在基因表型上起重要作用，可以引起单基因型糖尿病。携带这些突变基因的人群有很高的糖尿病发病率。然而，这类人群也仅占糖尿病总人数的一小部分，这些基因的发现揭示了葡萄糖稳态新的通路和机制。

目前GWAS芯片对2型糖尿病基因变异的检测，多数局限于白种人。未来，GWAS、外显子组和全基因组测序研究还需要兼顾分析其他人群和其他种类的遗传变异。随着高通量、低成本以及样本量的增加，人类在解开2型糖尿病复杂的遗传结构的进程中将会呈现前所未有的飞越。

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