王成兴 曾山崎 杨 平 张 通 魏建昌 陈华翠 曹 杰

广州医科大学附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东广州510180

巨细胞病毒嵌合癌胚抗原介导单纯疱疹病毒胸苷激酶联合丙氧鸟苷自杀基因体系靶向性治疗结肠癌的效果

王成兴 曾山崎 杨 平 张 通 魏建昌 陈华翠 曹 杰▲

广州医科大学附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东广州510180

目的观察巨细胞病毒（CMV）嵌合以癌胚抗原为启动子，以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组构建体Ad-CMV-CEA-HSV/TK联合丙氧鸟苷（GCV）体内抗结肠癌的疗效。方法构建人结肠癌裸鼠移植瘤模型，按不同浓度梯度Ad-CMV-CEA-HSV/TK（1.0×109/kg、5.0×109/kg、10.0×109/kg）经尾静脉注射带瘤小鼠后，腹腔注射相同浓度GCV（50 mg/kg），并设空白对照组及不同浓度的Ad-CEA-HSV/TK/GCV对照（1.0×109/kg、5.0× 109/kg、10.0×109/kg），共设A～G 7组，每组各10只小鼠。观察肿瘤体积、重量、肿瘤体积-时间曲线、肿瘤抑制率及生存期。结果Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV及Ad-CEA-HSV/TK/GCV对人结肠癌裸鼠移植瘤生长均具有抑制作用，对移植瘤的体积及重量抑制呈作用物浓度依赖性；且Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV抑制能力较Ad-CEAHSV/TK/GCV显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV体系对结肠癌具有明确的实验性治疗作用，为人结肠癌及结肠癌远处转移灶的Ⅰ期临床治疗试验提供科学实验依据，具有广阔的临床应用前景。

结肠癌曰基因治疗曰巨细胞病毒曰重组腺病毒曰癌胚抗原

结肠癌是严重危害人类健康的重大疾病之一，在北美、欧洲和澳大利亚，结肠癌发病率在消化道肿瘤中位居第一位，是肿瘤相关死亡病例中的第二位原因[1]。近20年来我国结肠癌发病率呈上升趋势，已经发展成为常见恶性肿瘤中发病率增长最快的恶性肿瘤[2]。传统的结肠癌治疗方案主要有手术治疗、放疗和化疗，而这些疗法或其联合疗法均不能达到令人满意的结果。近年来，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir，HSV-TK/GCV）自杀基因系统在肿瘤基因治疗研究领域成为热点[3-4]。本研究将验证嵌合巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）增强子的HSV-TK/GCV对肿瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

PRMI1640培养液、10%灭活胎牛血清、链-青霉素抗体均购自美国GIBCO公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；更昔洛韦（ganciclovir，GCV）购自湖北科益药业有限公司。人类中分化结肠腺癌SW480细胞株由广州医科大学实验中心细胞库提供。癌胚抗原启动子调控携带单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的重组腺病毒（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir controlled by CEA promoter，Ad-CEA-HSV/TK）、CMV增强子嵌入、癌胚抗原启动子调控携带HSV-TK基因的重组腺病毒（adenoviral mediated herpes simplex virus-thymidine kinase controlled by CMV-CEA promoter，Ad-CMV-CEA-HSV/TK）均由广州医科大学实验中心提供技术支持构建。按常规方法对重组腺病毒进行扩增、纯化和滴度测定，并置于-80℃保存备用；4～6周龄BALB/C裸鼠雌雄各35只，体重16～25 g，由中山大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK（粤）2009-0011，动物质量合格证号：0081587]。

1.2 实验方法

动物移植瘤模型的建立取对数生长期SW480细胞，用0.25%胰酶及0.20%乙二胺四乙酸消化传代，置于37℃含50%CO2恒温箱中培养，收集并调整细胞浓度为5×107个/mL的细胞悬液，取0.2 mL接种于裸鼠背部皮下，注射点选择左前背部皮下，待肿瘤长至直径约1.0 cm。试验裸鼠随机分为7组，每组10只，各组处理见表1。

1.3 疗效观察

观察3周，每隔1天测量1次肿瘤大小，计算肿瘤体积，肿瘤体积按公式计算：体积=长径×短径2× 0.5236，比较各组间肿瘤体积变化。肿瘤抑制率=（1-实验组平均重量/对照组平均重量）×100%，计算肿瘤生长抑制率并绘制生长曲线。实验结束后将实验动物寰椎脱离法处死，剥离瘤体，测量体积及瘤重。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 动物移植瘤模型分组及处理方法

2 结果

2.1 各组移植瘤体积比较

各组裸鼠皮下注射SW480细胞2～4 d均可触及小结节状移植瘤病灶，2周后肿瘤大小为1 cm，接种成功率为100%。就肿瘤生长情况而言，治疗开始后A组肿瘤持续快速生长，至实验结束时生存裸鼠移植瘤平均体积为（675.33±3.25）mm3；B、C、D组及E、F、G组肿瘤生长速度较A组明显减缓，B、C、D组随着药物浓度升高肿瘤体积递减，E、F、G组也呈相似变化，提示移植瘤体积与药物浓度呈反比；E、F、G组移植瘤体积较B、C、D组移植瘤体积增长明显减缓，差异有高度统计学意义（P＜0.001）。见图1。

图1 移植瘤体积生长曲线

2.2动物移植瘤抑制效应

B、C、G组治疗对人结肠癌SW480裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用，且瘤体体积及重量的抑制均呈浓度依赖性，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；E、F、G组瘤体体积及重量分别较B、C、D组小，抑瘤作用更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组裸鼠自实验开始3 d后出现死亡，实验结束时存活3只，而B、C、D、E、F、G组分别存活7、7、8、8、7、9只，结果提示B、C、D、E、F、F、G组生存率较A组显著提高，且E、F、G组生存率最明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 动物移植瘤抑制效应（n=10）

3 讨论

恶性肿瘤的基因治疗中，为了提高肿瘤组织特异性表达自杀基因TK或CD从而改善腺病毒自杀基因系统特异性或选择性杀死肿瘤细胞，近年来对腺病毒载体进行了改造，利用肿瘤组织特异性启动子如癌胚抗原（CEA）启动子，来驱动自杀基因表达[5-6]。因为CEA启动子只在CEA蛋白阳性细胞中，如结肠癌细胞，有驱动活性，而在CEA蛋白阴性细胞，如成人正常细胞，没有驱动活性。在正常情况下，CEA蛋白仅表达于胎儿组织，于成人组织CEA则不表达。然而，CEA蛋白则高表达于各种消化道恶性肿瘤组织中，如结肠癌几乎100%表达CEA[7]。研究表明，利用CEA启动子指导自杀基因表达已经明显提高杀伤肿瘤组织的特异性。然而这种CEA启动子指导的自杀基因表达活性很低，有其显著局限性[8]。有研究表明，CMV即刻早期基因的启动子-增强子系统是目前所知的最强的增强子-启动子系统，因而已广泛应用于各种真核表达载体中来驱动外源基因表达[9]。本研究将CMV增强子序列克隆至CEA启动子序列上游以形成一种嵌合型CMV增强子-CEA启动子，形成Ad-CMV-CEA-HSV/ TK/GCV治疗体系，与缺乏增强子的Ad-CMV-CEAHSV/TK/GCV及空白对照的疗效相比较，结果提示其不仅能保留CEA启动子结肠癌组织特异性，又能通过CMV增强子极大地提高CEA启动子驱动自杀基因表达的活性。

嵌合强效CMV增强子-CEA启动子-TK基因重组腺病毒联合GCV自杀基因治疗体系（Ad-CMV-CEAHSV/TK/GCV体系）的主要优点包括[10-14]：①肿瘤组织选择性。由于CEA高效表达于人结肠癌细胞而不表达于正常组织，因而该系统仅杀死CEA阳性的肿瘤细胞。②高效性。利用CMV增强子的高效性，来增强CEA启动子指导的自杀基因的高效表达，克服传统的腺病毒载体CEA启动子活性低的缺陷。③安全性。由于本研究采用复制缺陷型腺病毒载体，因而感染细胞后不会引起腺病毒在体内细胞中复制和感染扩散。④“旁观者”杀伤效应。由于本研究所采用重组腺病毒介导的自杀基因联合前药来治疗肿瘤，当部分肿瘤细胞受到感染并被杀伤，临近未被感染的肿瘤组织也被杀死，从而使该系统杀伤肿瘤细细胞效应得到扩大，称之为“旁观者”杀伤效应。

Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV体系克服了目前报道的病毒介导的自杀基因表达水平不高或缺乏肿瘤组织特异性的缺点。为人结肠癌及结肠癌远处转移灶的Ⅰ期临床治疗试验提供科学实验依据，具有广阔的临床应用前景。

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Therapeutic effect of cytomegalovirus chimeric carcinoembryonic antigen promoter combined with HSV-TK/GCV system for human colon cancer

WANG ChengxinZENG ShanqiYANG PingZHANG TongWEI JianchangCHEN HuacuiCAO Jie▲
Department of Gastrointestinal Surgery,the Affiliated Guangzhou First People's Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou510180,China

Objective To approach the treatment efficiency of replication defective adenovirus carrying HSV/TK gene under control of the cytomegalovirus union carcinoembryonic antigen promoter and ganciclovir(GCV)in nude mice xenografts model of human colon cancer.Methods The model of human colon cancer xenografts in BALB/c nude mouse was builded successfully.After injection of different concentration gradient of Ad-CMV-CEA-HSV/TK(1.0×109/kg, 5.0×109/kg,10.0×109/kg)in caudal vena,the same level of GCV(50 mg/kg)was given by peritoneal injection,and they were divided into the blank control group and Ad-CEA-HSV/TK control group with different concentration(1.0×109/kg, 5.0×109/kg,10.0×109/kg)were set,in total of 7 groups,each group of 10 mice.The anti-tumor efficacy was analyzed by index of tumor volume,tumor weight,relative tumor curative,and tumor growth curve.Results After therapy,growth of human colon cancer xenografts in nude mouse were observably inhibited by Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV and Ad-CEA-HSV/TK/GCV in a dose dependent,and there were no inhibition plateau.Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV showed a stronger inhibition ability than Ad-CEA-HSV/TK/GCV(P＜0.05).Conclusion Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV system is highly experimental effective and safe to inhibit the growth of human colon cancer xenografts,provides scientific basis forⅠperiod experimental of clinical treatment of human colon cancer and colon cancer distant metastases,and has a wide prospect of clinical application.

Colon cancer;Gene therapy;Cytomegalovirus;Recombinant adenovirus;Carcinoembryonic antigen

R735.35

A

1673-7210（2015）06（b）-0013-04

2015-02-05本文编辑：任念）

广东省科技计划项目（2009B060700015）；广东省广州市医药卫生科技一般引导项目（2009-YB-008）。

▲通讯作者