秦 宇 张劲松 闵晓洁 罗文婷 李 晶 赵江月▲

1.中国医科大学附属第四医院眼科中国医科大学眼科医院辽宁省晶状体学重点实验室，辽宁沈阳110005；2.中国医科大学附属盛京医院实验研究中心，辽宁沈阳110004

microRNA let-7a调控Caspase家族影响白内障发生的机制研究

秦 宇1张劲松1闵晓洁1罗文婷2李 晶1赵江月1▲

1.中国医科大学附属第四医院眼科中国医科大学眼科医院辽宁省晶状体学重点实验室，辽宁沈阳110005；2.中国医科大学附属盛京医院实验研究中心，辽宁沈阳110004

目的探讨microRNA let-7a靶向调控Caspase家族的机制及其在年龄相关性白内障发病过程中的作用。方法收集2014年7～9月在中国医科大学附属第四医院（以下简称“我院”）眼科诊断为年龄相关性白内障（排除其他眼部疾病）的患者晶状体前囊膜标本30例，作为实验组；同时收集我院眼科眼库提供的新鲜人眼透明晶状体前囊膜标本15例，作为对照组。利用生物信息学软件预测let-7a可能调控的Caspase家族中的关键基因；采用实时荧光定量PCR（Real time q-PCR）检测实验组和对照组let-7a及其预测靶基因的表达；利用Lipofectamine 2000瞬时转染let-7a mimic和inhibitor，调节人晶状体上皮细胞中let-7a的表达，利用Real time q-PCR法验证转染效率，并检测预测靶基因的表达变化。结果3种不同的生物信息学软件预测到Caspase家族中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9可能为let-7a的靶基因。与对照组比较，实验组let-7a的表达显著降低，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达显著升高。let-7a mimic转染组，let-7a的表达显著升高，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达显著降低；let-7a inhibitor转染组，let-7a的表达显著降低，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达显著升高；差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。结论let-7a可能通过靶向调控Caspase家族成员Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达，在年龄相关性白内障发病过程中发挥重要作用，let-7a可能成为白内障非手术治疗的新靶点。

微小RNA曰let-7a曰Caspase家族曰白内障

线粒体通路是最主要的凋亡通路，而晶状体上皮细胞凋亡是除先天性白内障外其他类型白内障形成的共同细胞学基础，因而线粒体通路在白内障的发病过程中发挥着重要作用。线粒体通路包括发挥凋亡调节作用的蛋白和发挥凋亡执行作用的蛋白，前者主要是B淋巴细胞瘤/白血病-2（Bcl-2）家族成员，后者主要是天冬氨酸特异性的半胱氨酸酶（Caspase）家族成员。Caspase家族包括凋亡启动蛋白酶如Caspase-8、Caspase-9等，和凋亡效应蛋白酶如Caspase-3等，其中Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白酶[1]。Caspase是凋亡信号转导网络的核心[2]。

微小RNA（microRNA）是一组全长21～25个核苷酸、内源表达、单链小分子非编码RNA，通过与靶基因的3’非翻译区（3’UTR）完全或不完全互补配对，抑制靶基因翻译或介导靶基因降解，从而在转录后水平发挥着重要的调控作用[3-4]。迄今发现的成熟microRNA有一千多种[5]，动物体内至少30%的基因表达受其调控。microRNA在疾病治疗中发挥着重要作用，特别是在慢性丙型肝炎、肝癌、血脂异常等疾病中的研究已取得突破性进展[6-8]。let-7a是最先被鉴定的microRNA之一let-7家族的一员[9]。let-7a在细胞增殖、凋亡、生长和转移等许多细胞生物学过程中发挥重要的作用[10-12]。本研究通过生物信息学软件预测let-7a可能与Caspase家族中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因存在潜在结合的位点。因此，本研究以let-7a和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9为研究对象，利用人晶状体上皮细胞系及细胞转染、荧光定量PCR（Real time q-PCR）等方法，探讨let-7a是否通过靶向调控其预测靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达，进一步调控细胞凋亡，从而在白内障发病过程发挥重要作用，探讨let-7a能否成为白内障非手术治疗的新靶点。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2014年7～9月在中国医科大学附属第四医院（以下简称“我院”）眼科诊断为年龄相关性白内障（排除其他眼部疾病）的患者行超声乳化白内障吸除术时撕囊的晶状体前囊膜标本30例，作为实验组。其中男17例，女13例，年龄50～70岁，平均（56.39± 5.13）岁。同时收集我院眼科眼库提供的新鲜人眼透明晶状体前囊膜标本15例，作为对照组。其中男9例，女6例，年龄50～70岁，平均（57.37±5.18）岁。组织标本收集经我院医学伦理学委员会批准，研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2 细胞培养和转染

人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）由美国Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠赠。SRA01/04细胞利用DMEM培养基（含10%新生牛血清，100 μg/mL的青霉素，100 μg/mL的链霉素），置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。let-7a mimic、inhibitor及其阴性对照由Ribobio公司（中国）合成。将SRA01/04细胞于转染前24 h接种于6孔细胞培养板中，使转染时细胞密度达到30%～50%。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）将50 nM let-7a mimic与let-7a mimic control、100 nM let-7a inhibitor与let-7a inhibitor control分别转染至SRA01/04细胞中，转染后48 h进行相关检测。

1.3 Real time q-PCR检测let-7a及其预测靶基因Caspase-3尧Caspase-8尧Caspase-9的表达

利用Trizol®Reagent（Invitrogen，NY，USA）提取总RNA，PrimerScriptTMRT Enzyme Mix（Takara，日本）逆转录为cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqⅡ（Takara，日本）检测let-7a的表达量，RNU6B为内参对照，检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达量，β-actin为内参对照。let-7a、RNU6B的RT引物、特异性上游引物和通用下游引物由Ribobio公司（中国）合成。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、β-actin引物由生工公司（中国）合成，见表1。利用ABI7500（AppliedBiosystems，USA），反应体系为20 μL，反应条件为95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。经过3次独立实验后得到的数据，利用公式RQ=2-△△Ct进行分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS16.0统计学软件，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、β-actin引物

2 结果

2.1 let-7a靶基因的预测

为探讨let-7a与Caspase家族成员间的潜在靶向关系，利用3种引用次数多、影响因子高、预测准确率高的生物信息学预测软件TargetScan 5.2，Dianamicro T和miRanda的交叉得分，预测出let-7a与Caspase家族中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9存在潜在结合位点（见图1～3），因此推测let-7a可能与Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9可能存在靶向关系。

图1 生物信息学软件预测的let-7a与Caspase-3的结合位点

图2 生物信息学软件预测的let-7a与Caspase-8的结合位点

图3 生物信息学软件预测的let-7a与Caspase-9的结合位点

2.2 let-7a在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达

采用Real time q-PCR法，检测实验组和对照组眼晶状体前囊膜中let-7a的表达情况，以RNU6B作为内参对照。结果显示，与对照组（1.000±0.002）比较，实验组let-7a的表达（0.620±0.019）显著降低，差异有高度统计学意义（t=8.227，P=0.001）。见图4。

图4 let-7a在两组眼晶状体组织中的表达

2.3 预测靶基因Caspase-3尧Caspase-8尧Caspase-9在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达

采用Real time q-PCR法，检测实验组和对照组眼晶状体前囊膜中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达情况，β-actin作为内参对照。结果显示，与对照组比较，实验组Caspase-3的表达显著升高[（1.00± 0.02）比（2.83±0.06），t=31.523，P=0.000]、Caspase-8的表达显著升高[（1.00±0.04）比（3.29±0.08），t=19.919，P=0.000]、Caspase-9的表达显著升高[（1.00±0.03）比（3.22±0.07），t=12.702，P=0.000]，差异均有高度统计学意义。见图5。

图5 预测靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达

2.4 验证转染效率

向人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）中转染let-7a mimic、mimic control、inhibitor、inhibitor control，为了验证转染效率，转染后48 h收集细胞，利用Real time q-PCR法，检测各组let-7a的表达情况。结果显示，与对照组（1.00±0.03）比较，let-7a mimic转染组（1530.00± 246.70）let-7a的表达显著升高（t=37.833，P=0.000），见图6A；let-7a inhibitor转染组（0.36±0.02）let-7a的表达较对照组（1.00±0.01）显著降低（t=11.085，P= 0.000），见图6B；差异均有高度统计学意义。证明转染有效可以进行后续实验。

图6 let-7a mimic和inhibitor转染效率的验证

2.5 let-7a对预测靶基因Caspase-3尧Caspase-8尧Caspase-9的调控

向人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）中分别转染let-7a mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control，转染后48 h，利用Real time q-PCR方法，检测各组预测靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达情况。结果显示，与对照组比较，转染let-7a mimic组，Caspase-3的表达显著降低[实验组：（0.326±0.019），对照组：（1.000±0.003），t=11.674，P=0.000，图7A]，Caspase-8的表达显著降低[实验组：（0.426±0.018），对照组：（1.000±0.005），t=5.125，P=0.007，图7A]，Caspase-9的表达显著降低[实验组：（0.389±0.016），对照组：（1.000±0.004），t=9.534，P=0.001，图7A]；而转染let-7a inhibitor组，Caspase-3的表达显著升高[实验组：（2.326±0.068），对照组：（1.000±0.005），t=13.199，P= 0.000，图7B]，Caspase-8的表达显著升高[实验组：（3.147± 0.078），对照组：（1.000±0.007），t=97.861，P=0.000，图7B]，Caspase-9的表达显著升高[实验组：（2.889± 0.069），对照组：（1.000±0.006），t=13.805，P=0.000，图7B]。差异均有统计学意义。

图7 let-7a对预测靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的调控

3 讨论

Caspase家族是线粒体通路中发挥凋亡执行作用的蛋白，属于天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶[2]，位于胞质中，发挥降解蛋白的作用，它有14个成员，分为两大类：一类是凋亡启动蛋白酶，如Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10，另一类是凋亡效应蛋白酶，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7；Caspase家族成员能被凋亡抑制蛋白家族（IAP）抑制，失去凋亡执行功能。换言之，IAP成员，如XIAP、c-IAPl等，可通过杆状病毒IAP重复结构域（BIR）与Caspase成员结合，抑制Caspase的活性，发挥抗凋亡作用[13]。Caspase家族引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节[14]，其激活主要包括线粒体依赖途径和死亡受体介导的信号转导途径，激活后的下游Caspase，通过切割特异性底物，导致细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白酶，Caspase-3的激活需要上游的Caspase-8或Caspase-9的活化，后者分别通过死亡受体途径和Cyt-C介导的线粒体途径来激活Caspase-3[2]。Caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。晶状体上皮细胞凋亡是除先天性白内障外其他类型白内障形成的共同细胞学基础。因而Caspase家族，特别是Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等在白内障的发病过程中扮演关键角色。

近年来microRNA的出现，为处于瓶颈期的白内障发病机制与非手术防治研究带来了新的启示。国内外研究已证实，microRNA在疾病治疗中发挥着重要作用。microRNA-122、microRNA-26a、microRNA-33a和microRNA-33b分别在慢性丙型肝炎、肝癌、血脂异常的治疗中发挥关键作用[6-8]。虽然目前大部分microRNA的功能及作用机制尚不清楚，但microRNA在未来人类疾病治疗领域，将发挥超乎想象的重要作用。近年来相继有microRNA在眼科领域的研究报道，但多限于microRNA表达检测，对其靶基因的预测及功能验证研究较少。Karali等[15]利用RNA原位杂交技术，检测不同发育阶段小鼠眼部组织中microRNA的表达情况。另有报道综合使用基因芯片和RNA原位杂交技术对角膜、晶状体、视网膜和色素上皮细胞中表达的microRNA进行了全面的检测，同时对从胚胎到出生后不同阶段鼠的眼部microRNA表达进行了报道[16]。

let-7a是最先被鉴定的microRNA之一let-7家族的一员[9]。let-7a能够抑制肝癌细胞增殖、生长和转移[10]，可能通过抑制c-myc基因的表达抑制人乳腺癌细胞增殖[11]，可促进黑素瘤细胞凋亡，同时下调Caspase-3蛋白的表达[12]。同时，let-7家族被证实与年龄相关性白内障的严重程度和发病年龄显著相关[17]。有文献报道，let-7a等通过靶向作用于线粒体通路基因，从而调控肿瘤细胞凋亡[18]。但是，let-7a调控线粒体通路基因，特别是Caspase家族成员，在晶状体疾病中的研究尚未见明确报道。

本研究发现，与正常人眼晶状体组织比较，年龄相关性白内障晶状体组织中，let-7a的表达显著降低，而通过生物信息学软件预测的其靶基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达均显著升高，符合microRNA通过与靶基因mRNA互补结合从而抑制靶基因表达的作用方式，因而推测let-7a与Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9之间可能存在靶向关系。为进一步证实Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9是否为let-7a的靶基因，本研究在人晶状体上皮细胞系调节let-7a的表达，观察Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达变化。本研究发现，let-7a表达升高时，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达均显著降低，而let-7a表达降低时，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达均显著升高。这一结果进一步表明let-7a与Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达符合microRNA抑制靶基因表达的作用方式。

综上所述，本研究结果提示，let-7a在年龄相关性白内障晶状体组织中呈低表达，let-7a可能通过靶向调控Caspase家族成员Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达，参与白内障的发病过程。let-7a作为白内障发病过程中的重要调控因子，可能成为白内障非手术治疗的新靶点，为进一步研究microRNA在白内障发生发展中的调控机制提供了理论与实验依据。

[1]Ashkenazi A，Dixit VM.Death receptors：signaling and modulation[J].Science，1998，281（5381）：1305-1308.

[2]Bratton SB，MacFarlane M，Cain K，et al.Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis[J].Exp Cell Res，2000，256（1）：27-33.

[3]Chen K，Rajewsky N.The evolution of gene regulation by transcriptionfactorsandmicroRNAs[J].NatRevGenet，2007，8（2）：93-103.

[4]Peters L，Meister G.Argonaute proteins：mediators of RNA silencing[J].Mol Cell，2007，26（5）：611-623.

[5]Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J].Cell，2007，129（7）：1401-1414.

[6]Lanford RE，Hildebrandt-Eriksen ES，Petri A，et al.Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection[J].Science，2010，327（5962）：198-201.

[7]Kota J，Chivukula RR，O'Donnell KA，et al.Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine liver cancer model[J].Cell，2009，137（6）：1005-1017.

[8]Rayner KJ，Esau CC，Hussain FN，et al.Inhibition of miR-33a/b in non-human primates raises plasma HDL and lowers VLDL triglycerides[J].Nature，2011，478（7369）：404-407.

[9]Reinhart BJ，Slack FJ，Basson M，et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature，2000，403（6772）：901-906.

[10]Liu YM，Xia Y，Dai W，et al.Cholesterol-conjugated let-7a mimics：antitumor efficacy on hepatocellular carcinoma in vitro and in a preclinical orthotopic xenograft model of systemic therapy[J].BMC Cancer，2014，14（1）：889.

[11]吴凯，吴爱国，李强，等.Let-7a沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制作用[J].广东医学，2010，31（10）：1260-1263.

[12]王震英，张捷，王焱，等.微小RNA-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞凋亡的影响[J].中华皮肤科杂志，2010，43（8）：575-578.

[13]Shi Y.Caspase activation，inhibition，and reactivation：a mechanistic view[J].Protein Sci，2004，13（8）：1979-1987.

[14]弓娟琴，陈志强，李文忠，等.Fas介导的凋亡与Caspase家族[J].国外医学：肿瘤学分册，2001，27（5）：279-280.

[15]Karali M，Peluso I，Marigo V，et al.Identification and characterization of microRNAs expressed in the mouse eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（2）：509-515.

[16]Karali M，Peluso I，Gennarino VA，et al.miRNeye：a microRNA expression atlas of the mouse eye[J].BMC Genomics，2010，11：715.

[17]Peng CH，Liu JH，Woung LC，et al.MicroRNAs and cataracts：correlation among let-7 expression，age and the severity of lens opacity[J].Br J Ophthalmol，2012，96（5）：747-751.

[18]Tsang WP，Kwok TT.Let-7a microRNA suppresses therapeutics-induced cancer cell death by targeting caspase-3[J].Apoptosis，2008，13（10）：1215-1222.

Research of microRNA let-7a targeted Caspase family in the pathogenesis of cataract

QIN Yu1ZHANG Jinsong1MIN Xiaojie1LUO Wenting2LI Jing1ZHAO Jiangyue1▲
1.Department of Ophthalmology,the Fourth Affiliated Hospital of China Medical UniversityEye Hospital of China Medical University Key Lens Research Laboratory of Liaoning Province,China,Liaoning Province,Shenyang110005, China;2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation,Shengjing Hospital,China Medical University, Liaoning Province,Shenyang110004,China

Objective To study the mechanism of microRNA let-7a targeted Caspase family in the pathogenesis of agerelated cataract.Methods 30 fresh specimens of anterior lens capsule of age-related cataract were obtained as experimental group from cataract patients with no other eye diseases during phacoemulsification at the Department of Ophthalmology,the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University(“our hospital”for short)form July to September 2014.15 normal anterior lens capsule specimens were obtained as control group from eye bank of Department of Ophthalmology in our hospital.Biological information softwares were used to predict potential target genes of let-7a in Caspase family.Real time q-PCR was used to measure the expression of let-7a and potential target genes between the experimental group and the control group.Let-7a mimic and inhibitor were transfected into SRA01/04 cells using Lipofectamine 2000 to regulate the expression of let-7a,and then real time q-PCR was used to assess transfection efficiency and the expression of potential target genes.Results Caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 were predicted as the potential target genes of let-7a using three different biological information softwares.Compared with control group,the expression of let-7a was significantly lower in the experimental group.On the contrary,the expression of Caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 increased in the same tissue specimens.The relative expression of let-7a in lens epithelial cells transfected with let-7a mimicincreased,whereas decreased in cells transfected with let-7a inhibitor.The expression of Caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 transfected with let-7a mimic were reduced,while increased in let-7a inhibitor group,the differences were statistically significant(P＜0.01).Conclusion Let-7a may play a critical role in the pathogenesis of age-related cataract by targeting caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 in Caspase family.Let-7a might be a new target for nonoperative treatment of cataract.

microRNA;let-7a;Caspase family;Cataract

R776.1

A

1673-7210（2015）06（b）-0004-06

2015-03-10本文编辑：任念）

国家自然科学基金资助项目（81270988，81470617）；辽宁省教育厅科学技术研究一般项目（L2014305）。

秦宇（1982-），女，博士，研究方向：晶状体疾病的临床与基础研究。

▲通讯作者