张 颖，肖 沙，徐 伟，刁庆春，郝 进

(重庆市第一人民医院/重庆市中医院皮肤科，重庆 400011)

·技术与方法·

雷公藤内酯醇的细胞内定位研究*

张 颖，肖 沙，徐 伟，刁庆春，郝 进△

(重庆市第一人民医院/重庆市中医院皮肤科，重庆 400011)

目的 检测雷公藤内酯醇的细胞内定位，探讨其在细胞内的作用位点。方法采用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素标记雷公藤内酯醇，与人肝癌细胞孵育；并与细胞核染料PI或细胞质膜染料DiI行双色荧光染色，用荧光显微镜观察。结果与对照相比，香豆素标记在紫外激发下呈特异性的淡蓝色荧光；与DiI共定位显示，香豆素标记在细胞质(膜)存在；与PI共定位显示，香豆素标记在细胞核存在，且荧光强于细胞质(膜)。结论雷公藤内酯醇在细胞内主要位于细胞核，其次是细胞质(膜)，提示雷公藤内酯醇可能主要在细胞核内起作用，其次是在细胞质(膜)上起作用。

雷公藤；香豆素；细胞定位

雷公藤属于卫予科多年生藤本植物，在我国广泛分布。作为传统中药的瑰宝之一，其应用于临床已有2000年的历史。中国医学最早利用其根茎提取物治疗风湿性疾病，如类风湿性关节炎[1]、系统性红斑狼疮[2]等。从上世纪80年代开始，在大量临床观察的基础上，雷公藤的适应证开始不断得以拓展，目前在皮肤科、眼科、肾内科、消化科等领域均有切实的临床应用。基础研究表明，雷公藤除了抗炎作用以外[3]，近年来的研究发现其对多种血液系统肿瘤、实体性肿瘤也具有较强的抗肿瘤活性，甚至对临床一些难治性或常规化学治疗药物耐药的肿瘤亦显示出明确活性[4]。

研究表明，雷公藤是通过几种活性单体协同而发挥其药理学活性的，其中一种二萜类化合物——雷公藤内酯醇(triptolide)为活性最强的单体[5]。遗憾的是，作为一种具有悠久历史的、已被广泛使用的药物，绝大多数的研究主要局限在雷公藤作用后细胞的功能性改变上，即雷公藤作用结果的观察上，而由于技术手段和研究方法的局限性，对雷公藤的细胞内起作用的位点还未获得足够的认识，导致对其作用机制研究未获突破。因此，对困扰临床的适应证问题和毒副作用问题目前仍不能准确阐释，对于药物的进一步改性也无从着手。为此，本研究首先从雷公藤内酯醇在细胞中起作用位点入手，通过4-溴甲基-7-甲氧基香豆素标记雷公藤内酯醇，于荧光显微镜下观察雷公藤内酯醇在细胞中的定位，为下一步分析雷公藤内酯醇的作用靶蛋白奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肝癌细胞(Hepal-6)购自中山医科大学实验动物中心；雷公藤内酯醇购自广州牌牌生物科技有限公司，纯度99%(hplc级)；4-溴甲基-7-甲氧基香豆素购自Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素混合液、胰蛋白酶、1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiI)、碘化丙啶(PI)购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hepal-6细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，辅加1%青/链霉素混合液。细胞置于37 ℃含有5% CO2的培养箱中培养，90%融合时用0.25%胰蛋白酶传代。

1.2.2 4-溴甲基-7-甲氧基香豆素标记雷公藤内酯醇的制备 参照文献，取雷公藤内酯醇10.00 mg，丁二酸酐15.00 mg，4-二甲氨基吡啶0.33 mg，溶解在1 mL的二氯甲烷中；用三乙胺调pH值至9～10；在磁力搅拌器的搅拌下，温室反应24 h；用大量温水洗涤反应物，将其中有机相烘干得到淡黄色晶体triptolide14-succinate；取上述反应物triptolide14-succinate 5.00 mg，4-溴甲基-7-甲氧基香豆素8.80 mg，碳酸钾50.00 mg；加入1 mL的丙酮溶剂中，在磁力搅拌器的搅拌下，37 ℃，反应1 h；用大量热水洗涤产物，取有机相，烘干即得黄色的香豆素标记的雷公藤内酯醇。

1.2.3 香豆素标记雷公藤内酯醇的细胞内定位 处于对数生长期的Hepal-6细胞，制备成1×105个/mL的细胞悬液，接种于含有盖玻片的六孔板内；24 h后加入香豆素标记雷公藤内酯醇和DiI，使二者的终浓度分别为4 μmol和5 μmol，置于37 ℃培养箱中孵育30 min；或者取出香豆素标记雷公藤内酯醇孵育后的细胞，4%多聚甲醛固定10 min，置于4 μmol的PI溶液中孵育30 min；孵育后的细胞用PBS清洗3次，于甘油中封片，荧光显微镜(Olympus X51)下观察，Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Inc.)拍照。

2 结 果

2.1 香豆素标记雷公藤内酯醇的细胞观察 采用香豆素标记雷公藤内酯醇与细胞孵育，荧光显微镜观察显示，香豆素在紫外光激发下产生淡蓝色荧光；而只孵育香豆素的对照未见荧光，表明香豆素可以特异性标记雷公藤内酯醇；基于细胞形态的初步观察表明，雷公藤内酯醇主要累积于细胞核内，其次是累积于细胞质(膜)中，见图1。

2.2 香豆素标记雷公藤内酯醇与DiI的共定位 为进一步明确雷公藤内酯醇的细胞分布，采用特异性染料DiI标记细胞质膜。与香豆素标记的共定位显示，香豆素的淡蓝色荧光与DiI的红色荧光在细胞质中重叠成紫色，表明雷公藤内酯醇在细胞质中的确存在，见图2。

A：只孵育香豆素的对照；B：香豆素标记雷公藤内酯醇孵育后。

图1 香豆素标记雷公藤内酯醇的细胞观察

2.3 香豆素标记雷公藤内酯醇与PI的共定位 进一步采用细胞核特异性染料PI标记细胞核，与香豆素标记的共定位显示，香豆素的淡蓝色荧光与PI的红色荧光在细胞核中重叠成紫色，表明雷公藤内酯醇在细胞核中的确存在(图3)。

A：香豆素标记；B：DiI标记；C：A和B的叠加。

图2 香豆素标记雷公藤内酯醇与DiI的共定位

A：香豆素标记；B：PI标记；C：A和B的叠加。

图3 香豆素标记雷公藤内酯醇与PI的共定位

3 讨 论

雷公藤内酯醇是卫矛科植物雷公藤的主要药效成分，是一类环氧化二萜内酯化合物，具有广泛的药理作用，包括抗炎、免疫调节、抗肿瘤等，应用于各种炎症性疾病和肿瘤的治疗，提高了患者的生活质量。一种化合物具有如此广泛的药理作用，必定有其多种作用机理。近来的研究表明，雷公藤内酯醇主要通过NF-κB、MAPK、Akt/mTOR等信号传导通路以及影响血管生成、细胞凋亡、肿瘤细胞增殖等生物学过程起作用[6-7]，但其在细胞中具体是通过哪些作用靶点而引起这些生物学效应的，一直没有得以充分阐明。本研究的结果提示雷公藤内酯醇的主要作用方式是在细胞核内直接调控基因转录，与其他研究者的结果相吻合[8-9]，合理解释了为什么雷公藤内酯醇具有如此广泛而强大的药理作用。本研究结果同时还表明，雷公藤内酯醇可能通过作用于细胞质内的靶蛋白或细胞膜受体参与细胞功能的调控。

香豆素及其衍生物是一类具有荧光特性的化合物，在荧光染色和标记等领域具有重要的作用。作为一种较新的荧光标记试剂，4-溴甲基-7-甲氧基香豆素具有荧光强度高、色彩明亮等优点，已被广泛应用于样本的痕量分析[10]。且其最大激发波长320nm，最大发射波长398nm，在紫外激发下发出明亮的淡蓝色荧光，在本研究中可以很好地与另外2种红色荧光染料(DiI和PI)实现区分和共定位。本研究的结[10]高倩倩，杨秀芬，欧敏．藤茶总黄酮和二氢杨梅素含药血清对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响[J]．中国中药杂志，2011，36(4)：500-503．

[11]Liu J,Shu Y,Zhang Q,et al.Dihydromyricetin induces apoptosis and inhibits proliferation in hepatocellular carcinoma cells[J].Oncol Lett,2014,8(4):1645-1651.

[12]Zeng G,Liu J,Chen H,et al.Dihydromyricetin induces cell cycle arrest and apoptosis in melanoma SK-MEL-28 cells[J].Oncol Rep,2014,31(6):2713-2719.

[13]Lin B,Tan X,Liang J,et al.A reduction in reactive Oxygen species contributes to dihydromyricetin-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J].Sci Rep,2014,4:7041.

[14]Wu S,Liu B,Zhang Q,et al.Dihydromyricetin reduced Bcl-2 expression via p53 in human hepatoma HepG2 cells[J].PLoS One,2013,8(11):e76886.

[15]李洁，熊兴耀，曾建国，等．白藜芦醇的研究进展[J]．中国现代中药，2013，15(2)：100-108．

[16]Winter M,Sombroek D,Dauth I,et al.Control of HIPK2 stability by ubiquitin ligase Siah-1 and checkpoint kinases ATM and ATR[J].Nat Cell Biol,2008,10(7):812-824.

[17]姬俊成，徐亮．胃癌靶向化疗及相关治疗的研究进展[J]．现代诊断与治疗，2009，20(1)：43-47．

[18]Haq R,Fisher DE.Improving apoptotic responses to targeted therapy[J].Oncotarget,2013,4(9):1331.

In-cell localization of triptolide*

ZhangYing,XiaoSha,XuWei,DiaoQingchun,HaoJin△

(DepartmentofDermatology,ChongqingFirstPeople′sHospital/ChongqingTraditionalChineseMedicineHospital,Chongqing400011,China)

Objective To clarify the cellular localization of triptolide and to explore its in-cell action sites.Methods4-(Bromomethyl)-7-methoxycoumarin was employed to label triptolide,then labelled triptolide was incubated with human hepatoma carcinoma cells.Subsequently,incubated cells were subjected to stain with fluorescent dye DiI or PI,which were specific to cytoplasmic membrane system and nucleus,respectively.ResultsCompared with the non-triptolide control,coumarin labelled triptolide shown a light blue fluorescence under UV excitation;Co-localization with DiI showed that triptolide exist in cytoplasm and(or) on cell membrane;Co-localization with PI showed that triptolide located in cell nucleus.Moreover,microscopic observation indicated that the fluorescence intensity in nucleus was denser than that in cytoplasm.ConclusionThe presnt study demonstrate that triptolide mainly act in nucleus,followed by acting in cytoplasm and(or) on cell membrane.

triptolide;coumarin;cellular localization

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.25.034

重庆市科委自然科学基金计划资助项目(cstc2011jjA10043,cstc2014jcyjA10130);重庆市中医院院内培育课题(2012-1-15)。

张颖(1985-)，硕士，主治医师，主要从事皮肤病学方面的研究。△

，E-mail:haojin_cq@163.com。

R93

A

1671-8348(2015)25-3556-02

2015-03-08

2015-05-16)