文∕郝 刚 俞蕴莉 顾炳仁

（1江苏省苏州市食品药品检验所；2江苏省苏州大学附属第二医院）

烟酸（Nicotinic Acid），又名尼克酸、维生素B3（或维生素PP），是人体必需的13 种维生素之一，具有促进细胞新陈代谢和扩张血管等功能，被广泛应用于医药、食品等领域。目前，市售的众多品牌奶粉中均将烟酸作为重要的营养成分进行添加。本试验基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，采用多反应监测方式（MRM），建立了快速测定奶粉中烟酸含量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四级杆液质联用仪，美国Waters公司；电喷雾离子源（ESI+）；Masslynx 4.1数据处理系统（Waters）；Thermo低温离心机；KQ-300DA型数控型超声波清洗器；MILLIPORE纯水仪；强阳离子交换（SCX）固相萃取柱（北京明尼克分析仪器设备中心）。

1.2 样品与试剂

烟酸对照品（批号201102，含量99.9%），购于中国食品药品检定研究院；乙酸铵，购于Sigmaaldrich公司；甲醇，色谱纯，购于Merk公司；氢氧化钠、盐酸、氯化钠等均为分析纯，购于国药试剂有限公司。试验用水为超纯水。试验所用样品均为市售奶粉。

1.3 UPLC 色谱条件

色谱柱：BEH-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）；流动相：A（含20 mmol/L乙酸铵的水溶液）∶B（甲醇）=20∶80（v/v）；柱温：30 ℃；进样盘温度：4 ℃；流速0.3 mL/min；进样量：1 µL。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源；正离子扫描；毛细管电压4.0 kV；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气体流量：800 L/h；锥孔气流量：150 L/h；碰撞气体为氩气，碰撞能18 eV；多反应检测模式（MRM）下，测定烟酸的检测离子对分别为：m/z 124→106和m/z 124→80。

1.5 标准溶液配制

精密称取烟酸对照品约10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，作为烟酸对照品储备液（10 µg/mL），4 ℃避光保存。临用前用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液。

1.6 样品前处理

称取1 g奶粉置于烧杯中，加入适量的45～50 ℃的温水将其溶解，冷却至室温后，加水补足100 mL，充分溶解、混匀后，取10 mL样品溶液于50 mL聚丙烯离心管中；加入10 mol/L的氢氧化钠0.1 mL、5 g氯化钠和40 mL水，涡旋振荡3 min，8 000 r/m离心5 min。取上清液10 mL置于另一个50 mL聚丙烯离心管中，加入0.2 mol/L的盐酸40 mL，涡旋振荡3 min，8 000 r/m离心5 min，取上清液10 mL上样至SCX小柱中。然后依次用3 mL水，1 mL 0.2 mol/L的盐酸和3 mL甲醇淋洗，用4 mL氨水-甲醇（体积比1∶3）洗脱，洗脱液经氮气吹干后用流动相定容至10 mL，0.22 µm滤膜过滤，取1 µL滤液进样分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确定

将烟酸对照品储备液用甲醇稀释成200 ng/mL的对照溶液，选用ESI+离子化模式，通过直接进样法进行质谱条件优化。首先，采用一级质谱扫描方式得到烟酸准分子离子峰m/z：124[M+H]+，结果如图1－（A）所示。在确定准分子离子的基础上，进行锥孔电压优化，得到最佳锥孔电压为30 V，锥孔气流量为150 L/h。再通过Daughter Scan扫描模式，对烟酸的分子离子进行二级碎片离子扫描，结果如图1－（B）所示。烟酸二级扫描的特征离子对为：m/z 124→106和m/z 124→80，这2 个特征离子对作为烟酸定性判断的依据。最后，基于烟酸的2 个特征离子对建立MRM方法，烟酸的MRM离子流色谱图如1－（C）所示，并选择其中响应较强的离子对（m/z 124→80）作为定量离子对。

图1 质谱条件优化结果

2.2 专属性

分别取空白奶粉（经测定不含烟酸的奶粉样品），空白奶粉添加至200 ng/mL水平的烟酸对照品，按“1.6 样品前处理”方法经提取、固相萃取后进样分析。同时用甲醇配制200 ng/mL的烟酸对照品溶液进样分析，考察所建立方法的专属性，结果如图2所示。烟酸对照品溶液的MRM离子流色谱图保留时间为0.45 min，空白样本在该保留时间处无干扰，空白样品添加烟酸对照品溶液后，MRM离子流色谱图保留时间不变，且峰形良好，所建液相及质谱方法适合奶粉中烟酸的定性、定量检测。

图2 专属性试验结果

2.3 线性范围

取烟酸对照品储备液，分别配制成终浓度为1，2，5，20，50，100，200，500 ng/mL的系列标准溶液，按上述液相及质谱方法，各取1 µL进样分析，采集MRM离子流色谱图，以m/z 124→80为定量离子对，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，结果如图3所示。从图3可以看出，烟酸在1～500 ng/mL浓度范围内线性良好，线性方程为Y=9855X+93501，相关系数：R=0.9995。

图3 烟酸线性范围考察结果

2.4 检出限与定量限

2.4.1 仪器检出限与定量限

空白奶粉溶液中分别添加至0.1 ng/mL和0.3 ng/mL浓度水平的烟酸对照品，经提取、固相萃取后，进样分析，结果如图4－（A）所示，0.1 ng/mL浓度的烟酸信噪比（S/N）为6.8，该浓度作为烟酸的仪器检出限（S/N>3）；0.3 ng/mL浓度的烟酸信噪比（S/N）为13.97（如图4－（B）所示），该浓度作为烟酸的仪器定量限（S/N>10）。

图4 烟酸检出限（A）、定量限（B）试验结果

2.4.2 方法检出限与定量限

根据“1.6 样品前处理”的方法，样品实际稀释倍数为2 500 倍，计算该方法下的方法检出限为0.25 µg/g，方法定量限为0.75 µg/g。

2.5 回收率和精密度

取空白奶粉溶液，分别添加2 ng/mL，20 ng/mL，200 ng/mL共3 个浓度水平的烟酸对照品溶液，按本试验方法进行处理，每份样品重复测定6 次，试验结果如表1所示。考察烟酸低、中、高3 个浓度下的方法回收率，在78.2%～90.4%范围内，方法精密度（以相对标准偏差RSD表示）小于7%。

表1 空白样品中烟酸的加标回收率和精密度（n=6）

2.6 实际样品测定

选取市售6 种不同批次标示含有烟酸成分的奶粉，按所建方法进行样品处理并检测烟酸含量，结果如表2所示。从表2可以看出，6 种批次奶粉中烟酸含量的实测值均在“80%标示值～120%标示值”范围内，符合我国《食品营养成分标示准则》的相关规定。

表2 奶粉样品分析结果

3 讨论

目前，国内外检测烟酸含量的方法主要包括滴定法、微生物法、高效液相色谱法、电化学法、气相-质谱联用法等。我国《食品安全国家标准》中规定了婴幼儿食品和乳品中烟酸的测定方法为高效液相色谱法和微生物法（GB 5413.15－2010）。本试验基于超高效液相色谱的快速分离能力及三重四级杆质谱的定性、定量优势，开发快速测定奶粉中烟酸含量的检测方法。试验结果表明，不含烟酸的空白奶粉样品经提取、固相萃取后，在MRM监测模式下对烟酸的基线分离无影响，方法专属性强，且烟酸保留时间仅为0.45 min，大大缩短了分析时间。进一步分析目前市售各种品牌的奶粉营养成分表发现，多数品牌奶粉中烟酸的含量在1～10 mg/100 g范围内，本试验中所建立的烟酸对照品溶液的线性范围为1～500 ng/mL。结合所建方法的提取、固相萃取过程，根据样品稀释倍数和回收率的计算结果，该方法运用在实际样品的检测中，线性范围可达0.25～125 mg/100 g，基本满足目前市售的不同品牌奶粉中烟酸的测定要求，且方法回收率在78.2%～90.4%范围内，精密度小于7%。进一步运用所建方法对市售6 批奶粉中的烟酸含量进行检测，结果均符合规定。综上所述，本试验所建立的奶粉中烟酸含量检测方法具有专属性强、灵敏度高、线性范围广、分析时间短等优点，为奶粉中烟酸的检测提供了新的选择。

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