张玉梅，王家晓

(广西中医药大学第一附属医院肿瘤科，南宁530023)

乳腺癌(breast cancer)是最常见的女性恶性肿瘤之一。多年来，乳腺癌发病率在发达国家一直占女性恶性肿瘤的首位。近年来中国的乳腺癌发病率在逐年上升且出现年轻化的趋势。据统计，全球乳腺癌新发病例在过去30年间(1980年—2010年)逐年上升，年增长率达3.1%。2010年全世界乳腺癌患病人数更是高达164.3(142.1～178.2)万人［1］。乳腺癌的发生发展是多基因参与、多阶段的复杂过程，是细胞中多种基因表达改变累积的结果。在此过程中既有原癌基因的激活、抑癌基因的失活，也有细胞周期的调控和凋亡基因的改变以及细胞内调节环节的紊乱［2-3］。石榴皮是石榴科植物石榴的干燥果皮，性酸、味涩，具有涩肠、止血、杀虫的功效。现代药理学研究表明，石榴皮具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和抗氧化等作用，从其当中提取的鞣花酸具有很强的抗肿瘤活性［4］。本研究通过石榴皮鞣花酸对乳腺癌4T1细胞体外增殖和细胞凋亡的影响，并观察其对乳腺癌4T1荷瘤小鼠的肿瘤抑制情况，以探讨石榴皮鞣花酸可能的抗癌机制。

1 实验材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 纯系BALB/C小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，购于广西中医药大学实验动物部，小鼠4T1乳腺癌细胞株由广西中医药大学免疫学实验室惠赠。RPMI1640培养基，美国GIBCO公司生产。胎牛血清，美国HyClone公司生产。石榴皮鞣花酸购自上海谱振生物科技有限公司，纯度为96%。SP试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，CCK-8杀伤活性测定试剂盒购自Promega公司。

1.2 细胞培养 小鼠4T1乳腺癌细胞以含10%胎牛血清的 RPMI1640在37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天换液1次，0.25%胰酶消化传代。取对数生长期细胞制备单细胞悬液进行不同的实验。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖率

1.3.1 标准曲线制备 取处于指数增殖期的小鼠4T1乳腺癌细胞，按照不同的细胞密度接种于96孔板中，培养24 h后每孔加入10 μL的CCK-8，继续培养4 h，于酶标仪上450 nm比色测吸光度值，根据检测结果绘制细胞增殖标准曲线，见图1。

图1 小鼠4T1乳腺癌细胞增殖标准曲线

1.3.2 细胞增殖抑制率检测 取处于指数增殖期的肿瘤细胞按照5×104/mL接种于96孔培养板，设置对照组和实验组，每个剂量和对照均设3复孔。实验组加入不同浓度石榴皮鞣花酸(10、20、30 mg/mL)，设为高、中、低剂量组对照组设生理盐水组和DDP组，分别加等量的生理盐水和DDP，加药共培养48 h后加入CCK-8，同上检测细胞450 nm比色测吸光度值，细胞增殖抑制率=(1－实验组OD值/阴性对照组)×100%。

1.4 细胞周期分析 取指数增殖期的小鼠4T1乳腺癌细胞种植于6孔板中，细胞种植密度为104/mL，每孔3 mL。设置对照组和实验组，实验组加入不同浓度石榴皮鞣花酸(10，20，30 mg/mL)，设为高、中、低浓度组，对照组加生理盐水，共培养48 h后收集细胞，PBS洗2次，使用30%PBS乙醇重悬细胞沉淀，摇匀后向细胞悬液中加入5 mL的PI，闭光作用5 min后上机检测细胞周期。

1.5 小鼠4T1乳腺癌荷瘤小鼠的建立 于6周龄BALB/C小鼠右侧腋窝皮下接种小鼠4T1乳腺癌细胞0.1 mL(含5×105个小鼠4T1乳腺癌细胞)，12 d之后肿瘤直径达0.5 cm大小时即成小鼠4T1乳腺癌荷瘤小鼠。

1.6 观察石榴皮鞣花酸对乳腺癌荷瘤小鼠的保护作用将52只BALB/C乳腺癌荷瘤小鼠随机分为4组，石榴皮鞣花酸高剂量组，石榴皮鞣花酸低剂量组，DDP组和生理盐水组，每组13只。接种小鼠4T1乳腺癌细胞后第2天开始灌胃，连续灌胃给药10 d，鞣花酸高剂量组每天1次灌注0.4 mL鞣花酸高浓度稀释液(相当于鞣花酸30 mg/mL)，鞣花酸低剂量组每天1次灌注0.4mL鞣花酸低浓度稀释液(相当于鞣花酸10 mg/mL)，DDP组每天1次灌注0.4 mL DDP稀释液(相当于DDP 5 mg/mL)，生理盐水组每天1次灌注0.4 mL生理盐水。连续喂养3周。另外以13只正常小鼠每天1次灌注0.4 mL生理盐水作为对照组。

1.7 胸腺系数、脾系数测定 上述各组小鼠在连续喂养3周后处死，处死前称量小鼠质量，处死后先无菌取出小鼠胸腺和脾脏，并分别称重。胸腺系数=(胸腺质量/小鼠质量)×100%。脾系数=(脾质量/小鼠质量)×100%。

1.8 抑瘤率及瘤体survivin表达情况 上述各组荷瘤小鼠在连续喂养3周后处死，取出荷瘤小鼠瘤体，分别称重，各组荷瘤小鼠抑瘤率的计算参照文献［5］进行。将所取瘤体组织的石蜡切片采用免疫组织化学SP法进行染色。Survivin结果判定标准参照Bames等［6］提出的基于3个参数的半定量计数方法判定。

1.9 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(珋±s)表示，多组均数比较采用方差分析，等级资料比较采用秩和检验，计数资料比较采用χ2检验，两两比较采用Nemenyi法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 石榴皮鞣花酸对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖的影响 石榴皮鞣花酸对小鼠4T1乳腺癌细胞具有明显的增殖抑制作用。不同浓度的鞣花酸组对小鼠4T1乳腺癌细胞抑制增殖作用的时间曲线基本相同，都是在共培养48 h最明显。鞣花酸中剂量组与高剂量组的抑制增殖作用比低剂量组差异有统计学意义(P＜0.05)。但中剂量组与高剂量组的鞣花酸差异无统计学意义，提示鞣花酸对小鼠4T1乳腺癌细胞的增殖可能有饱合抑制作用。结果详见表1。

2.2 石榴皮鞣花酸对小鼠4T1乳腺癌细胞的诱导凋亡作用 流式细胞仪细胞凋亡计数结果显示，不同浓度石榴皮鞣花酸在一定时间范围内，诱导肿瘤细胞凋亡的作用随药物浓度及作用时间的增加而增强，但当鞣花酸到达一定浓度(20 mg/mL)后凋亡诱导作用逐渐趋向稳定，见图2。

表1 石榴皮鞣花酸对小鼠4T1乳腺癌细胞的抑制作用(珋±s，n=13)

表1 石榴皮鞣花酸对小鼠4T1乳腺癌细胞的抑制作用(珋±s，n=13)

注:各组分别与对照组分别比较，#P＜0.05;与鞣花酸10 mg/mL组分别比较，▲P＜0.05

组别 质量浓度/(mg/mL)4T1乳腺癌细胞(OD值)抑制率/%对照组 0.367±0.251 31.3 DDP组 15 0.175±0.021 52.3石榴皮组 10 0.313±0.017# 14.7石榴皮组 20 0.259±0.015#▲ 29.4石榴皮组 30 0.252±0.016#▲

图2 不同药物浓度细胞凋亡情况

2.3 细胞周期分析 不同浓度鞣花酸与小鼠4T1乳腺癌细胞共培养后，细胞周期分布发生了明显变化，G1期的细胞均增加明显，G2/M期的细胞出现减少，并且可见到较明显的凋亡峰形成。各浓度组G1期细胞与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);鞣花酸3个浓度组中，低剂量组分别与中剂量组和高剂量组进行比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但中剂量组与高剂量组进行比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。结果详见表2。

表2 石榴皮鞣花酸作用后小鼠4T1乳腺癌细胞周期分布比较(珋±s，n=13)

表2 石榴皮鞣花酸作用后小鼠4T1乳腺癌细胞周期分布比较(珋±s，n=13)

注:不同浓度石榴皮组与对照组比较，▲P＜0.05;10 mg/mL组与其余2个浓度组比较，△P＜0.05

组 别 质量浓度/(mg/mL)G1期 S期 G2/M期23.21±4.21 34.29±3.77鞣花酸 10 47.43±1.67▲ 33.31±2.79 15.02±1.67鞣花酸 20 55.61±1.63▲△ 16.91±3.53 27.52±3.31鞣花酸 30 57.02±1.92▲△对照组 35.40±1.43 17.85±5.25 23.46±4.53

2.4 石榴皮鞣花酸对荷瘤小鼠的保护作用 鞣花酸低剂量组(鞣花酸10 mg/mL)和高剂量组(鞣花酸30 mg/mL)可抑制小鼠4T1乳腺癌细胞的生长，抑瘤率分别为21.3%和27.8%，均低于DDP组的71%。4组瘤体质量、胸腺系数、脾系数比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。鞣花酸低剂量组、鞣花酸高剂量组瘤体质量小于生理盐水组(P＜0.05)，但大于DDP组(P＜0.01)。鞣花酸低剂量组、高剂量组胸腺系数、脾系数分别与生理盐水组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，提示石榴皮对小鼠4T1乳腺癌细胞有一定的抑制作用，同时可防止胸腺和脾萎缩。DDP组胸腺系数、脾系数均低于生理盐水组(P＜0.05)，提示DDP组胸腺和脾萎缩明显，见表3。

表3 石榴皮鞣花酸对4T1乳腺癌BALB/C荷瘤小鼠的抑瘤作用(珋±s，n=13)

表3 石榴皮鞣花酸对4T1乳腺癌BALB/C荷瘤小鼠的抑瘤作用(珋±s，n=13)

注:与生理盐水组比较，#P＜0.05

组 别 瘤体质量/g 胸腺系数/(g/10 g)脾系数/(g/10 g)生理盐水组 1.69±0.34 0.010±0.003 0.064±0.016 DDP组 0.49±0.14# 0.006±0.002# 0.021±0.005#鞣花酸低剂量组 1.33±0.35# 0.011±0.002 0.065±0.013鞣花酸高剂量组 1.22±0.54# 0.009±0.003 0.063±0.014

2.5 各组瘤体survivin的表达情况 各组survivin的表达情况比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。DDP组、鞣花酸低剂量组、高剂量组survivin阳性率均低于生理盐水组(P＜0.05)，但DDP组、鞣花酸低剂量组和高剂量组荷瘤小鼠瘤体survivin阳性率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 各组荷瘤小鼠瘤体survivin的表达情况(n=13)

3 讨论

恶性肿瘤是全世界较为常见的疾病，其发病率呈逐年上升的趋势，恶性肿瘤共同的生物学特征为失控性生长，其主要的分子机制可能由于多步骤、多阶段、多基因参与使细胞增殖和分化失控从而引起细胞恶性转化，导致肿瘤的发生［7-8］。因此抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化及凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段之一［9-10］。Survivin在胚胎时期广泛分布于不同组织，在人类分化成熟的组织中一般不表达或低表达。Survivin表达则凋亡过程受阻导致细胞异常增殖［11］。在本研究中，石榴皮鞣花酸对乳腺癌4T1细胞具有明显的增殖抑制作用，4T1细胞与石榴皮鞣花酸共培养后，4T1细胞生长明显受到抑制;细胞周期分布发生了明显变化，G1期的细胞均增加明显，G2/M期的细胞出现减少，并且可见到较明显的凋亡峰形成;荷瘤小鼠经胃灌注鞣花酸后，荷瘤小鼠肿瘤生长受到抑制，荷瘤小鼠瘤体组织survivin表达情况，阳性表达均低于生理盐水组，表明肿瘤细胞凋亡增加，同时荷瘤小鼠胸腺系数、脾系数未出现明显下降，表明鞣花酸在抑制4T1乳腺癌生长的同时可防止胸腺和脾萎缩，并进而提高机体免疫力。以上结果表明，石榴皮鞣花酸不仅对肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用，鞣花酸可能主要通过对肿瘤细胞周期的改变引起肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡受抑导致病变组织内肿瘤细胞存活时间延长，破坏细胞群体内存活与死亡的平衡，存活细胞数大于死亡细胞数，则肿瘤细胞数量净增多［12-13］，而且鞣花酸可提高机体免疫力，从而进一步对肿瘤细胞产生作用。但是当鞣花酸浓度升到一定值后，对肿瘤细胞的抑制作用往往逐渐呈饱合状态，鞣花酸在中剂量组与高剂量组的细胞抑制率差异无显著性，鞣花酸与肿瘤共培养后检测细胞周期后也发现，中剂量组与高剂量组石榴皮的G1期细胞差异也无统计学意义，这也提示鞣花酸对肿瘤细胞的抑制可能有饱合抑制，这也可能是提示石榴皮鞣花酸虽然有一定抗肿瘤作用，但疗效仍有待提高的瓶颈原因。

本实验证实石榴皮鞣花酸对4T1乳腺癌细胞的增殖和侵袭具有抑制作用，且效果显著，本研究结果为石榴皮鞣花酸作为抗肿瘤药物提供了一定的理论依据。

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