高月红，邹梅芳，李

(武进中医医院，江苏 常州213000)

宫颈癌是女性生殖道常见的恶性肿瘤［1］。全世界每年约有50万宫颈癌新发病例，我国每年的新发病例超过13万，占世界发病的28%。近年来，由于社会经济发展及人们生活方式的变化，宫颈癌的发病呈逐年升高趋势，且“年轻化”明显。国外学者就人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的关系进行了大量的研究，发现96.6%的宫颈癌标本中可检测出HPV病毒基因组或基因片段［2］。而且流行病学和分子生物学的研究也证实宫颈癌的发病与HPV感染密切相关［3］。人乳头瘤病毒16型(HPV16)2个早期编码框架E6，E7基因的表达产物E6，E7原癌蛋白在肿瘤发生、细胞周期的调控及凋亡中起到重要作用［4］，因此阻断HPV16的E6，E7基因的表达，可能成为治疗HPV相关性肿瘤的有效手段。本研究采用血清药理学研究思路，采用灵敏度高、特异性强的Western Blot法，观察中药复方排毒止带汤对HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表达的影响。

1 实验材料

人宫颈癌细胞系:SiHa，细胞于含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基中培养。96孔细胞培养板购自Costar公司，RMPI-1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自GIBCO公司，兔抗人HPV E6多克隆抗体、兔抗人HPV E7多克隆抗体、兔抗人P53多克隆抗体、兔抗人pRb(Ser795)磷酸化多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体、HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗兔二抗购自EnoGene公司，RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 含药血清制备 选清洁级雌性健康SD大鼠18只，体质量为100～150 g，南京医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号:SCXK(苏)2008-0004。随机分为3组，空白对照组口服生理盐水，25%含药血清组及50%含药血清组口服复方排毒止带汤煎剂。中药复方排毒止带汤处方由白花蛇舌草15 g，苦参10 g，黄柏 10 g，紫草10 g，莪术10 g，怀牛膝 10 g，黄芪10 g，将1剂复方药物水煎去渣制成水煎液，制成150 mL/袋，2袋，中药液浓度为0.25 g/mL，水煎液由常州市武进中医医院提供。该水煎液经10倍浓缩后制成浓度为2.5 g/mL中药液，于4℃冰箱密封保存。给药剂量按人临床给药剂量的等效剂量的10倍给药，计算公式为:200 g体质量大鼠给药剂量=70 kg体质量人给药剂量×0.018×10。中药复方排毒止带汤人日服300 mL(75 g生药)，大鼠给药剂量为5.4 mL 10倍浓缩液(2.5 g/mL)/200 g体质量，即13.5 g生药/200 g体质量，每日灌胃给药1次，连续给药7d，末次灌胃给药后1 h取血。分离血清，血清置于56℃水浴30 min灭活补体，分装于1 mL无菌管中置于－80℃冰箱冷藏备用。

2.2 药物处理 实验前一天将5×105的SiHa细胞接种至6孔板中，用2 mL的MEM培养液或含排毒止带汤血清的MEM培养液培养。

2.3 总蛋白提取 含药血清作用一定时间后，各组细胞弃去培养液，PBS漂洗2次，加以冰预冷的RIPA裂解液(1 × PBS，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，100 μg/mL PMSF)冰上裂解，超声波处理(7 micro，30 s，4 次，每次间隔 1 min)，离心，取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白含量。

2.4 蛋白免疫杂交 每孔蛋白上样40 μg，经分离胶为10%的SDS-PAGE凝胶电泳后，将SDS-PAGE凝胶80V恒压转移40 min电转印至PVDF膜。取下PVDF膜，做好标记，将PVDF膜放入10%的BSA中4℃封闭过液。将封闭好的PVDF膜加入一抗(1∶1 000，4℃孵育过夜，洗涤)，二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，1∶10 000，室温孵育1 h)，T-PBS洗涤。采用ECL化学发光显色试剂盒检测、摄影。

2.5 统计学方法 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件。计量资料用均数±标准差(珋±s)表示，2组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

排毒止带汤50%含药血清作用于SiHa人宫颈癌细胞 72 h HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表达分别为:(0.73±0.05)，(0.69±0.04)，(1.51±0.05)，(1.75±0.06);排毒止带汤50%含药血清作用于Si-Ha人宫颈癌细胞120 h HPV16 E6，E7，p53，pRb 蛋白表达分别为:(0.59±0.05)，(0.19±0.06)，(1.80±0.02)，(2.48±0.09)。2者相应指标比较，P ＜0.05，差异有统计学意义。复方排毒止带汤25%含药血清作用 120 h HPV16 E6，E7，p53，pRb 蛋白表达分别为:(0.79±0.08)，(0.92±0.08)，(0.91±0.05)，(2.14±0.09);复方排毒止带汤50%含药血清作用120 h HPV16 E6，E7，p53，pRb 蛋白表达分别为:(0.60±0.05)，(0.61±0.05)，(1.50±0.04)，(2.31±0.09)。2组相应指标比较，P＜0.05，差异有统计学意义。实验结果见图1。

排毒止带汤50%含药血清作用于SiHa人宫颈癌细胞72 h即可下调HPV16 E6，E7蛋白表达水平，并上调p53、pRb蛋白表达水平。排毒止带汤50%含药血清作用于SiHa人宫颈癌细胞120 h，HPV16 E6，E7蛋白表达水平下降，p53、pRb蛋白表达水平增加。2组相应指标比较P均＜0.05，差异有统计学意义。复方排毒止带汤含药血清对HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表达影响具有一定的时效性。实验结果见图2。

复方排毒止带汤25%含药血清作用120 h出现HPV16 E6、E7蛋白表达水平下降，p53、pRb蛋白表达水平增加。复方排毒止带汤50%含药血清作用120 h HPV16 E6、E7蛋白表达水平下降，p53、pRb蛋白表达水平增加。2组相应指标比较P均＜0.05，差异有统计学意义。复方排毒止带汤含药血清浓度对HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表达影响存在差异。实验结果见图3。

图1 Western Blot法检测排毒止带汤含药血清对SiHa人宫颈癌 HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表达的影响

图2 复方排毒止带汤50%含药血清对SiHa人宫颈癌细胞HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表达的影响

图3 排毒止带汤不同浓度含药血清作用120 h对SiHa人宫颈癌细胞HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表达的影响

4 讨论

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，其发生与高危型人乳头瘤病毒(HPV)的感染，p53，pRb抑癌基因分子突变，E6，E7原癌基因的激活，某些化学致癌物等密切相关［5］。1)E6蛋白能特异性与p53蛋白结合［6］，经过泛素途径快速诱导p53降解，E7蛋白可与pRb结合，活化核转录因子，p53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因［7］，从而使 p53和pRb丧失对细胞生长的调节作用，导致细胞永生化，甚至恶性转化。2)E6，E7可与宿主细胞DNA发生高亲和度的非特性结合，干扰基因的转录及表达。3)E6，E7可激活某些原癌基因，如C-myc，C-fos等，使细胞恶性转化。4)E6在有效降解p53的同时，使E7高表达，避免了细胞的凋亡，INK4A对E6具有抑制作用，E7使得INK4A功能丧失，间接完成对E6协同作用。

中医认为，宫颈癌患者多因房事不洁或接触污秽之品，湿、热、毒邪结聚，日久导致气血阻塞，耗伤气血，损伤正气所致。本病病机为正气虚弱，下元不足，湿热毒邪瘀结于胞宫子门，治疗以“扶正祛邪”为宗旨。中药复方制剂排毒止带汤由白花蛇舌草、苦参、黄柏、紫草、怀牛膝、黄芪等组成，具有祛湿清热，解毒化瘀，益气和血之功效。方中紫草、苦参等对HPV有明显抑制作用［8-9］。紫草的单味药药理研究也表明其含有抗病毒及提高免疫力的作用。现代研究中黄柏对钩端螺旋体、乙肝表面抗原等有抑制作用，对血小板有保护作用，还有促进小鼠抗体生成作用［10］。黄芪对机体免疫系统影响广泛，以免疫增强、免疫调节为主。由于中药进入体内后存在药物的吸收和代谢过程，以中药体外直接作用于细胞往往无法客观的评价药物进入体内的效应，本研究另辟蹊径，采用血清药理学的研究思路，采用灵敏度高、特异性强的Western Blot法，发现中药复方制剂排毒止带汤对HPV16 E6，E7蛋白存在明显的抑制作用，能明显提高抑癌基因p53和pRb的水平，但其作用机制有待进一步深入探讨。

近年来在HPV感染相关的宫颈癌治疗方面，祖国医学取得较大的研究进展。王华等［11］采用中药制剂疣毒净胶囊治疗宫颈高危型HPV感染，发现治疗组治愈率65%，明显高于对照组40.63%。徐侠等［12］采用清热解毒扶正方治疗HPV16/18型感染52例，有效率44.23%，明显高于对照组11.54%。本研究发现，复方排毒止带汤含药血清对人宫颈鳞癌Si-Ha细胞HPV16 E6，E7，p53，Rb蛋白表达具有明显调控作用，表明复方排毒止带汤具有抗HPV16作用。未来研究将建立动物宫颈癌模型，重点研究复方排毒止带汤对HPV感染相关宫颈癌的治疗，为临床工作提供指导。

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