王衍慧，傅明捷，黄玉宇，李 静

(广州市第一人民医院，广州510180)

随着人们生活水平提高、生活方式改变及社会老龄化问题日益严重，糖尿病(DM)发病率逐年上升，目前我国约有9 240万DM患者，已成为全球DM第一大国［1］。糖尿病肾病(DN)作为DM常见的微血管并发症，是终末期肾病最常见的原因［2］，也是DM的重要致死、致残原因。本研究采用动态血浆蛋白质组学的研究方法，探讨了DN与健康人群血浆差异蛋白表达，旨在为筛选DN血浆蛋白标志物提供理论和实践依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年10月～2013年10月住院的DN患者4例，均符合王海燕主编的《肾脏病学》(3版)中的诊断标准及1999年WHO糖尿病诊断标准［3］。男2例、女2例，年龄56～62岁。选择同期来自体检中心的健康查体人群4例作为健康对照，男2例、女2例，年龄55～63岁。纳入标准:符合诊断标准者;年龄18～80岁;血肌酐≤140 μmol/L;知情同意者。排除标准:妊娠、哺乳期妇女;血肌酐＞140 μmol/L;合并原发性心血管、肝脏、神经系统、血液系统疾病;合并严重感染等并发症者。

1.2 方法

1.2.1 血清采集及处理 清晨空腹抽取两组静脉血10 mL，速冻存于液氮中，置于-70℃保存，备双向电泳及质谱分析用。

1.2.2 双向电泳及质谱分析

1.2.2.1 组织总蛋白抽提及蛋白质测定 将血清以12 000 r/min，4℃离心30 min后，吸取上清入EP管，用50 mmol/L氢氧化钠调节pH值至8.5，取5 μL用于蛋白质浓度测定，其余上清置于-70℃保存备用。采用2D Quant Kit蛋白质定量试剂盒测定总蛋白浓度，其操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，绘制标准曲线，计算直线回归方程。

1.2.2.2 蛋白质荧光染料标记 每组蛋白质均取25 μg等量混合作为内标，50 μg内标蛋白用 400 pmol Cy2进行标记，分别以50 μg蛋白每400 pmol Cy3和400 pmol Cy5标记，冰上避光放置30 min，再加1 μL亮氨酸(10 mmol/L)中止反应10 min。

1.2.2.3 荧光差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)和图像扫描 50 μg Cy2、Cy3和Cy5标记的样品进行混合，加等体积的2×样品缓冲液(8 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，2%Bio-lyte pH 4～7，130 mmol/L DTT)，再加适量水化液(8 mol/L尿素，4%CHAPS，1%Bio-lyte pH 4～7，13 mmol/L DTT)补至总体积450 μL，上样，30 V水化13 h，然后经过100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，最后稳定在8 000 V下进行等电聚焦8.5 h。电泳后取出IPG胶条先后置入平衡A液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mmol/L 尿素，30% 甘油，1%SDS，0.2%DTT，痕量溴酚蓝)和平衡B液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mmol/L 尿素，30% 甘油，1%SDS，3% 碘乙酰胺，痕量溴酚蓝)中各平衡15 min。平衡后的胶条移至浓度12.5%PAGE分离胶上端用0.5%琼脂糖封胶，2.5 W电泳30 min，然后以11 W恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳。整个过程均避光操作。双向电泳后，取出胶条擦洗干净，轻置Typhoon扫描仪，以Cy2(488 nm激发激光和520BP40发射过滤器)、Cy3(532 nm激发激光和580BP30发射过滤器)和Cy5(633 nm激发激光和670BP30发射过滤器)设置进行扫描，获得分析使用的凝胶图像。另需制作一块制备胶，步骤同2D-DIGE，其上样为1 000 μg内标蛋白，电泳后考马斯亮蓝进行染色用于差异蛋白的质谱鉴定。

1.2.2.4 图像分析 用DeCyder 5.0软件分析2DDIGE图像。首先对每一张胶图上的所有蛋白质点扫描进行胶内分析，对不同胶的同一个蛋白质点与内标匹配，检测每个点的容积(背景删减后)、面积、峰值，计算每组(Cy3/Cy2，Cy5/Cy2)成像的标准丰度比值;然后对不同胶上的同一个蛋白质点与内标匹配，进行胶间分析，对匹配后每个蛋白质点的相对量进行比较分析后确定差异蛋白，筛选分析图像出现并比率≥1.5，P≤0.05的差异点。在制备胶上找到与分析胶上的差异点匹配的质点，取点、脱色、酶解及样品萃取，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行检测，获取肽质量指纹图谱及PKL文件，在NCBInr蛋白质数据库中进行蛋白质匹配。

1.2.3 统计学方法 采用 SAS12.0统计软件，差异蛋白质分析用One Way ANOVA方法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 图像分析 使用DeCyder5.0软件分析，在每块胶图上检测到蛋白斑点约1 300个。DN患者血浆与健康对照血浆比较，上调或下调1.5倍为截断值，同时满足P＜0.05的差异斑点有6个，见图1。

2.2 差异表达蛋白鉴定 质谱分析并通过蛋白质数据库(UniProtKB/Swiss-Prot)比对鉴定出6种蛋白质，分别为补体C3、C4、凝溶胶蛋白前体、纤维蛋白原γ、载脂蛋白E和细胞骨架蛋白16。见表1。

图1 DN患者血浆差异表达蛋白质分布峰度图

表1 差异表达蛋白鉴定结果

3 讨论

DN的发病受多种因素影响，发病机制至今未完全阐明［4～6］。蛋白质组学技术作为一种全新的系统生物学研究方法，为揭示DN的病因病机提供了帮助［7］。蛋白质组学是对机体、组织或细胞的全部蛋白质表达水平、蛋白修饰与功能、蛋白之间相互作用等进行高通量的筛选和分析，比传统的单个基因研究或单个蛋白研究更能增加疾病诊断、预后判断的可靠性，更能准确反映机体的状态［8，9］。本研究用蛋白质荧光染料标记DN及健康对照的蛋白质，进行2D-DIGE，并扫描获得分析使用的凝胶图像。对扫描后的荧光染料标记分析胶图像进行图像分析，分析后确定差异蛋白。

本研究成功构建了2D-DIGE DN患者血浆蛋白图谱，并分析鉴定出6种差异表达蛋白;质谱分析并通过蛋白质数据库(UniProtKB/Swiss-Prot)对比鉴定出6种蛋白质，分别为补体C3、C4、凝溶胶蛋白前体、纤维蛋白原γ、载脂蛋白E和细胞骨架蛋白16，为进一步筛选DN血浆蛋白标志物提供依据。

补体C3是人体重要的免疫球蛋白，参与机体体液免疫激活过程，其分子量为195 kD，主要由巨噬细胞和肝脏合成，在C3转化酶的作用下，裂解成C3a和C3b两个片段，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。本研究中补体C3在DN患者与正常人群中呈现差异表达，提示其参与了DN的发生与发展过程，可作为DN的重要血浆分组标志物［10，11］。载脂蛋白E是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可调节许多生物学功能，与多种代谢疾病有关。近年研究显示，载脂蛋白E与机体免疫调节功能有关，在一定程度上可抑制机体过度免疫反应，包括抑制T细胞的增殖与趋化，调节巨噬细胞吞噬功能，从而达到调节机体炎症免疫反应［12，13］。本研究通过 2D-DIGE，发现DN患者与正常人群中载脂蛋白E存在表达差异，提示其可能参与了DN的发病过程，并可能作为其早期预警的分子标志物［14，15］。

总之，本研究采用血浆蛋白质组学技术，应用2D-DIGE，初步筛选出了DN与正常人群差异表达的血浆蛋白，为下一步进行的前瞻性大规模临床对照研究提供了一定的理论和实践依据。

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