周奕+邓志伟+艾卫敏+等

摘要目的：比较研究Aβ在两种AD转基因小鼠模型脑杏仁核分布的差异.方法：采用18月龄雄性APP/PSl双转基因（2×TgAD） 小鼠与同龄同性别APP/PSl/tau三转基因（3×TgAD）小鼠，分别进行6E10单克隆抗体免疫组化染色等方法显示Aβ阳性神经元及斑块，观察其分布与形态等的差异，图像分析系统定量比较其量的变化.结果：在杏仁核2×TgAD组Aβ阳性产物主要位于细胞外成为细胞外Aβ（eAβ），形成大量的Aβ阳性斑，Aβ阳性神经元少；而3×TgAD组 Aβ阳性产物主要位于神经元细胞内，成为细胞内Aβ（iAβ），但Aβ阳性斑少见.结论：2×TgAD组与3×TgAD组 Aβ阳性产物在杏仁核分布的差异可能反映了两种AD小鼠模型神经病理等改变的不同.

关键词阿尔茨海默病；转基因小鼠；β淀粉样蛋白；杏仁核

中图分类号R74916文献标识码A文章编号10002537（2014）05002605

AD的病因及发病机制复杂，有多种学说，至今仍未阐明.Aβ学说是目前普遍认同的AD主要发病机制之一：Aβ在脑内异常聚集并纤维化形成SPs，其神经毒性作用可破坏钙离子平衡、诱发氧化应激、激活小胶质细胞产生炎症反应、激活凋亡相关蛋白等启动凋亡程序并导致广泛的神经元丢失，进而形成认知功能损害，出现相应的痴呆症状[68].用于AD研究的动物模型有很多种，且各具特点.其中过度表达人类家族性突变的APP基因和PS1基因的 2×TgAD 小鼠，以及过度表达APP、PS1和tau基因的 3×TgAD 小鼠均能模拟出AD的某些神经生物学特征性改变，然而针对这两种动物模型脑内重要区域Aβ分布的比较还未见报道.本研究通过Aβ单克隆抗体（6E10）免疫组化染色结合形态学分析等方法，比较18月龄 2×TgAD 与 3×TgAD 小鼠杏仁核中Aβ分布的差异，探讨两种AD小鼠模型病理形态等的不同.

3讨论

本研究观察到2×TgAD组杏仁核可见大量6E10免疫阳性斑，这与其他研究者的报道是一致的[911].说明在这类转基因AD小鼠模型中，细胞外Aβ（extracelluar βamyloid ，eAβ）的沉积是其主要的病变.eAβ在AD病理过程中的作用有较多研究报道，主要表现在以下几方面：（1）eAβ可诱发脑内免疫炎症反应.eAβ可激活小胶质细胞和补体系统，释放促炎因子，诱导炎症反应发生，从而导致神经元退行性变[12].人们在AD患者脑中发现，在SPs的核心周围可见聚集的小胶质细胞并与SPs相互交错，小胶质细胞的异常激活同AD的神经病理改变有一定的联系，据此推测eAβ可能是通过免疫炎症反应促进AD的发生.临床流行病学调查表明，长期服用抗炎药物后AD发病率减低，并对认知功能具有保护作用.（2）Nelson 等发现eAβ可使某些抗氧化酶活性降低从而导致氧自由基的浓度异常升高，其可能是诱发AD的机理之一[13].eAβ也可通过其它多种途径诱导蛋白质过氧化物、脂质过氧化物大量产生.这些产物的增加可导致神经元产能障碍，最终启动细胞的凋亡过程.（3）异常增加的eAβ的作用曾经被认为还通过多种方式尤其是诱发细胞凋亡的途径，从而引起神经元退行性变.支持该观点的依据有：与早期家族性AD相关的PS1、PS2、APP基因突变可使eAβ含量增加；Aβ降解酶基因的多态性，其中包括编码人胰岛素降解酶的基因，可能导致AD的发生；实验动物治疗研究发现抗Aβ治疗有一定疗效.因此，清除eAβ及eAβ神经毒性，曾经是AD治疗的主要研究方向.然而，Aβ免疫实验仅起到轻微延缓AD进程的作用并出现了无菌性脑炎的严重副作用而被迫中断[1416].近年来，人们通过对AD转基因小鼠及AD病人的脑组织的研究，发现存在细胞内Aβ，并对AD病理的发展起重要作用.

作者在对3×TgAD组的研究中发现，eAβ阳性斑块小且少，而神经元内有很多6E10阳性产物即细胞内Aβ（intracelluar βamyloid ，iAβ），这种现象还少见报道.近年来，神经元iAβ的存在与作用越来越受到人们的重视，其在AD中的作用也是多方面的：（1）iAβ可影响突触功能[17].Meng等通过尸体解剖发现在AD的早期即出现明显的突触可塑性的改变[18].Gimenez等发现3×TgAD转基因小鼠1到4个月时，皮质、杏仁核等部位的突触间传递丧失了近40%，而通过免疫组化等方式仅能检测到iAβ[19].提示：AD早期在无细胞外斑块形成的情况下iAβ积聚，导致突触的损害.这可以解释老年斑形成和认知障碍之间的不一致性.（2）iAβ可导致线粒体受损[20].线粒体通过氧化磷酸化作用产生能量物质ATP，同时参与维持正常的细胞内钙离子平衡.此外，线粒体在控制细胞凋亡中担当重要角色.线粒体的功能障碍会导致ROS产生过度和细胞色素C的释放，并将促使凋亡肽酶激活因子与细胞凋亡蛋白酶9前原蛋白结合，启动凋亡过程.（3）ZHANG等通过对原代培养的人类神经元细胞内显微注射Aβ可出现P53和Bax蛋白介导的选择性杀伤作用[2122].（4）iAβ多肽与细胞内载脂蛋白E的聚集密切相关，而后者与DNA断裂和细胞溶解有紧密联系.（5）iAβ还可通过减低特异的蛋白磷酸酶活性和（或）增强糖原合成酶活性诱导tau蛋白的异常磷酸化，从而损伤神经元.此外，在自然衰老的恒河猴脑中，Aβ同样被发现于神经元和非神经元细胞内，早于淀粉样斑块的形成；同时证明Aβ寡聚体可以引发神经元退行性变[23].

杏仁核（amygdale）是大脑边缘系统的重要组成部分，其具有调节内脏活动、处理情感反应及记忆等功能[2425].Horínek等通过MRI研究发现在AD的早期诊断中杏仁核与海马有着相同的诊断价值，并且认为两者在短期记忆过程中都担当着重要的角色；当AD出现轻微的精神症状时，杏仁核普遍发生了早期的损害[24].Hampel等研究表明杏仁核不仅是AD脑内重要的病变部位之一，而且其Aβ异常沉积发生的时间可能比海马、皮质等区域更早[25].上述研究表明杏仁核与AD有密切的关系.

作者比较了18月龄时2×TgAD与3×TgAD小鼠模型杏仁核Aβ分布特点.结果发现：2×TgAD组Aβ沉积主要发生在细胞外，3×TgAD组Aβ沉积主要发生在细胞内.在其他脑区也存在类似的表达差异.造成这种差异的原因目前还不清楚，有待深入研究.Aβ与AD的神经病理改变有着密切的关系，但Aβ如何引起神经元退行性变，其最初的作用位点是在细胞外还是细胞内，至今仍存在争议.由于3×TgAD小鼠过度表达的tau基因可能影响Aβ聚集的部位，并且3×TgAD小鼠早期即有明显的神经元死亡、突触丢失及学习记忆行为的改变[26]，据此作者推测iAβ的神经毒性可能在神经元退行性改变并导致AD发生的过程中发挥重要作用.

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（编辑王健）