李 莹，李 莉，刘艳玲，李剑梅，王艳华，朱万芹

(1.沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁 沈阳 110086;2.辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

杏 鲍 菇 (Pleurotus eryngii(DC.et.Fr.)Quèl.)又名刺芹侧耳，因其主要发生于伞形花科(Umbelliferae)、刺芹属(Eryngium)、刺芹(Eryngium campestre)枯死的植株根上而得名，是一类分布广范的木腐生真菌，主要分布于北非、南欧、中亚地区的高山、草原、沙漠地带，在我国新疆、青海、四川等地也有分布［1］。其子实体含有丰富的营养成分，具有重要的经济价值，是近年来开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌［2］。简单序列重复区间扩增多态性(Inter-simple Sequence Repeat，ISSR)是 Zietkiewicz等基于SSR技术发展起来的一种新型的微卫星类分子标记技术，其基本原理是在SSR序列的3'端或5'端加锚1～4个随机的碱基为引物，对两侧具有反向排列的简单序列间的基因片段进行扩增［3］。ISSR分子标记技术适用于任何物种，可同时提供多位点信息，并揭示不同位点个体间变异的信息［4］，该标记通常为显性标记，符合孟德尔遗传，稳定性和可重复性高，引物具有通用性［5］。由于ISSR分子标记技术能够从基因水平揭示菌株间亲缘关系和遗传差异［6］，并具有简单、快速、通用性好、稳定性高等优点［7］，已在食用菌种质资源研究、菌株鉴别和菌株遗传多样性等方面得到了广泛应用［8］。本实验利用ISSR分子标记技术对20株杏鲍菇菌种进行遗传多样性分析，可为杏鲍菇遗传资源的保护、利用及育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 本实验共收集了20株杏鲍菇菌种(表1)，其中12株是保藏菌种(编号1～12)，8株是工厂化栽培菌种(编号13～20)。

表1 20株杏鲍菇菌种Table 1 20 strains of Pleurotus eryngii

1.1.2 PDA综合培养基(g/L) 马铃薯200，葡萄糖 20，琼脂 15，蛋白胨 5，KH2PO43，MgSO41.5，VB11 片。

1.1.3 主要试剂和仪器 电泳仪(DDY-III，北京六一仪器厂)，手动型生物安全柜(SPX-safe-1200，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，PCR仪(Applied Biosystems GeneAmpPCR System 2700)，CTAB(天津博迪化工有限公司)，Tris碱(国药集团化学试剂有限公司)，Taq DNA聚合酶、dNTP、琼脂糖(北京康为世纪公司生物科技有限公司)，ISSR引物(北京华大基因)。

1.2 方法

1.2.1 菌丝培养 将纯化的20株杏鲍菇菌种接于PDA综合培养基中，25℃培养。菌丝长满后，刮下菌丝放入－20℃冰箱保藏备用。

1.2.2 DNA提取 供试菌种基因组DNA的提取采用 CTAB 法［9］。收集菌丝约 0.2 g，置于 1.5 mL离心管中，加入0.2 g灭菌的石英砂，研磨5～10 min，再加入500 μL 65 ℃预热的2 ×CTAB，65℃水浴60 min，每隔5～10 min颠倒1次;加500 μL氯仿 ∶异戊醇(24∶ 1)，颠倒混匀10 min，12000 r/min，4℃离心10 min，取上清，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12000 r/min，4℃离心10 min，重复1次;取上清加入2/3体积的－20℃异丙醇，1/10体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2)，混匀，－20℃放置90 min至过夜;12000 r/min，4℃离心 10 min，出现沉淀，弃液相，加入－20℃的75%乙醇500 μL，上下颠倒洗涤，重复1次;弃乙醇，晾干，加入 100 μL TE 溶解 DNA，－20℃保存备用。

1.2.3 ISSR-PCR扩增 按照DNA序列的排列规律，加拿大哥伦比亚大学(University Of British Columbia，UBC)公布了一套(100条)ISSR引物，可针对研究材料选择合适的引物［10］。本实验从UBC提供的引物序列中选择了22条ISSR引物(表2)，交由华大基因合成。由于可能缺乏同源位点，导致ISSR扩增无产物，为了简化实验并得到清晰有效的ISSR分子标记，以杏1、杏9为DNA模板，对22条引物进行了初步筛选以及ISSR-PCR反应体系的优化。通过筛选得到扩增条带清晰、反应稳定、多态性丰富的ISSR的引物，并对20株杏鲍菇菌种进行ISSR-PCR扩增。

25 μL 反应体系:10 ×Taq PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 2 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，DNA 模板 1.5 μL，ddH2O 16.5 μL。PCR 扩增程序:94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸7 min。PCR产物用含有0.1 μL/mL嗅化乙锭(EB)的1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，100 V恒压30 min，电泳缓冲液为1×Tris-乙酸(TAE)，拍照记录。

表2 ISSR引物序列(5'～3')Table 2 ISSR primer sequences(5'～3')

1.2.4 ISSR-PCR 数据统计分析 以“0”和“1”的方式记录电泳结果条带的位置，有条带赋值“1”，无条带赋值“0”，构建0/1初始数据矩阵，在NTSYSpc 2.10e 软件中，Similarity-Qualitative data程序的SM计算品种的遗传相似系数，Clustering-SHAN程序中的非加权组平均法(Unweightedpairgroup method with arithmetic means，UPGMA)进行聚类分析，通过Graphics-Tree plot程序构建20株杏鲍菇菌种的聚类分析图谱。

2 结果与分析

2.1 ISSR多态性分析

通过对22条引物的初步筛选以及ISSR-PCR反应体系的优化，得到 11 条(807、810、818、826、835、836、840(图1)、841、842、889、891)扩增条带清晰、反应稳定、多态性丰富的ISSR引物，每条引物的扩增实验均重复3次，以保证准确性。结果显示，每条引物对不同菌种扩增的DNA条带数目不等，在2～9条之间，产物片段大小在100～5000 bp之间。11个引物共获得74个ISSR标记位点，多态性位点51个，多态比率为68.92%，平均每个引物扩增出6.73个位点。

2.2 遗传相似性分析

菌株间的遗传相似系数(geneticsimilarity，GS)是指两个体间共同分子标记位点占两个体总位点的比率，用于衡量两个体间遗传差距的大小。结果显示(表3)，20株杏鲍菇菌种的遗传相似系数变异范围为0.53～0.95，遗传差异变化较大，遗传背景丰富。杏3与DM2、杏6与杏9、杏3寿与杏1(内)两两之间的相似系数最大为0.95，表明它们之间的遗传差异最小，亲缘关系最近;杏5X-42与杏丰68的相似系数最小为0.53，说明二者的遗传差异最大，亲缘关系最远。

图1 ISSR引物840对20株杏鲍菇菌种的扩增图谱Fig.1 The ISSR profiles of 20 strains of Pleurotus eryngii by primer 840

2.3 ISSR聚类分析

表3 20株杏鲍菇菌种间的相似系数Table 3 Similarity coefficients among 20 strains of Pleurotus eryngii

电泳图谱中的每1条扩增条带均代表了引物与模板DNA互补的一对结合位点，同一引物扩增的产物中电泳迁移率一致的条带被认为属于同一位点［11］。结果显示(图2)，20株杏鲍菇菌种的相似系数在0.62～0.95之间，当遗传相似系数为0.828时聚为4个类群，遗传相似系数为0.896时聚为12个类群，其中杏528寿与其他菌种的亲缘系数最远，具有独立的遗传体系。遗传相似系数大说明二者的遗传差异小，当遗传相似系数为0.95时，来源地不同的杏1(内)与X杏、杏6与杏9，及来源地相同的杏3与DM2，两两之间亲缘关系较近，可能为同种异名［12］，说明ISSR分组与菌株的不同地理来源之间无明显的相关性，同时也说明菌种命名存在同种异名和同名异种的混乱现象，通过分子标记的方法进行分析，为杏鲍菇品种鉴定提供借鉴，有助于规范杏鲍菇菌种市场，保护广大种植户的利益。

图2 20株杏鲍菇菌种的ISSR遗传分析聚类图Fig.2 Dendrogram of cluster among 20 Pleurotus eryngii strains based on ISSR analysis

3 讨论

分子标记是以生物个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析，受外界环境的影响较小［13］。ISSR分子标记是一种新型的DNA分子标记技术，由于其具有快速、稳定、重复性好、通用性强等优点而被广泛应用于种质资源鉴定、遗传作图、基因定位、系统发育等方面，尤其是在品种鉴定和亲缘关系分析方面，因其具有较高的多态性，可有效地进行种间、种内亲缘关系的鉴定。

本实验从22条引物中筛选出11条扩增条带清晰、多态性好的ISSR引物，这11条引物均为二核苷酸的重复序列，说明在选择ISSR引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少选寡聚三核苷酸、四核苷酸重复序列的引物。对20株杏鲍菇菌种进行11条引物的ISSR-PCR扩增，共获得74个标记位点，其中有 51个多态性位点，多态性为68.92%。聚类分析的结果表明，当系数为0.896时，20株菌种被分为12个类群，杏528寿与其他菌株亲缘系数最远，具有独立的遗传体系。实验表明，ISSR分子标记能较好地反映杏鲍菇菌种间丰富的遗传多样性，进一步为ISSR标记在杏鲍菇遗传多样性上的应用提供理论依据。

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