凌辉生，储迅涛，曾敏霞（珠海市丽珠试剂股份有限公司，广东珠海 519060）

人细小病毒B19（HPV B19）简称B19病毒，是1975年Cossort首次发现的一种单链线状小DNA病毒，属于细小病毒科，是目前细小病毒科中唯一引起人类疾病的病原体。B19病毒能通过胎盘感染胎儿，引起胎儿水肿、自发性流产、死胎和感染性红斑等多种疾病，对胎儿及婴幼儿有较大的危害［1－2］；也可通过血液制品的输注传染给受血者，成为血液制品的主要污染源之一［3］。因此，研究分析有关HPV B19病毒感染的诊断方法及防治措施，对促进孕妇健康、优生优育及血液制品的安全使用都有重要意义。

1 材料与方法

1．1 标本来源 选择珠海市妇幼保健院孕妇血清、血浆标本115份及珠海血站健康献血者血清、血浆样品共1 700份作为研究材料。HPV B19－IgM阴性血清和阳性血清来自珠海市妇幼保健院。

1．2 试剂与仪器 HPV B19－VP1蛋白购自美国Fitzgerald公司，浓度1．36mg／mL；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgM（使用滴度1∶5 000）和IgG－类风湿因子吸收剂购自深圳菲鹏生物有限公司；对照试剂B19IgM酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自德国维润赛润研发有限公司；其他如包被液、封闭液以及显色系统均为本公司自产；ELISA用96孔酶标板（可拆式）购自厦门怡佳美实验器材有限公司。

1．3 方法

1．3．1 B19IgM 间接ELISA的建立 棋盘法进行间接ELISA最佳试剂工作条件的确定。（1）包被：以系列浓度的包被抗原（1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000）包被酶标板，2～8℃孵育过夜，次日，弃去孔内溶液，洗涤；（2）封闭：每孔封闭液120μL，37℃条件下孵育3h，洗涤；（3）加入待检血清（经IgG－类风湿因子吸收剂处理），100微升／孔，37℃孵育60min；洗涤；（4）加酶标二抗：将酶标二抗分别稀释至1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000，加入上述反应孔中，37℃孵育30min，洗涤；（5）底物显色：于各反应孔中加入底物缓冲液、底物液各50μL，37℃孵育15min；（6）终止反应：于各反应孔中加入终止液50μL；（7）A450／630值测定，由阳性／阴性（P／N）值选择最佳抗原包被浓度和酶标二抗的最佳工作浓度。

1．3．2 重组蛋白 HPV B19－VP1包被方式的确定 将重组HPV B19－VP1蛋白用包被缓冲液稀释至最佳浓度后，分别采用37℃孵育60、120、180min和2～8℃过夜包被处理，进行试验，根据结果计算P／N值，选择最佳包被条件。

1．3．3 IgG－类风湿因子吸收剂使用量的确定 按上步试验确定的抗原包被浓度及酶标记物浓度，IgG－类风湿因子按不同比例使用，选择合适的IgG－类风湿因子吸收剂使用量以及IgG－类风湿因子吸收剂的最适作用时间和最适反应温度。

1．3．4 酶标二抗最佳工作时间的确定 将酶标二抗稀释至最佳工作浓度后，每孔加入100μL，于37℃分别孵育10、20、30、40、50、60min，每个反应重复2次。其他条件及操作方法相同，进行试验。

1．3．5 底物显色时间的确定 按已确定的包被浓度、酶标记物浓度及酶标记物反应时间；控制底物显色时间分别为30、25、20、15、10、5min，选择适当的底物显色时间。

1．3．6 临界值的确定 用建立的间接ELISA方法检测500份HPV B19－IgM阴性血清，对A450／630值进行频数分布分析，确定阴性均值）和标准差（s），以＋2s）计算临界值。

1．4 间接ELISA检测方法性能评价 （1）敏感性试验：将5份HPV B19－IgM阳性血清和1份阴性血清分别作1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000稀释，用已建立的ELISA方法检测。（2）重复性试验：对包括阴性血清在内的4份样品进行3批批内和3次批间重复性试验，测定A450／630值，计算每份血清A450／630值的和s，以确定批内和批间试验的变异系数（CV）。（3）临床样品的检测：应用本试验建立的间接ELISA检测方法检测1 700份健康献血者血清、115份孕妇血清的HPV B19－IgM抗体，以对照试剂盒检测结果为参考进行比较分析。

2 结 果

2．1 最佳包被浓度和酶标二抗工作浓度的确定 选定阳性血清的A450／630值1．0左右，且P／N值最大反应孔的抗原及酶标二抗的稀释倍数作为二者最佳的稀释倍数。故抗原稀释倍数为1∶2 000和酶标二抗稀释倍数为1∶2 000时，阳性血清A450／630值较大（1．031），且P／N值最大（19．453），因此抗原最佳包被滴度为1∶2 000，而最佳酶标二抗工作滴度为1∶2 000。见表1。

2．2 最佳包被条件的确定 以最佳包被浓度包被后，分别37℃包被60、120、180min和2～8℃包被过夜，包被后进行试验，结果显示当包被条件为2～8℃过夜时P／N值最大，因此确定最佳包被条件为2～8℃包被过夜。

2．3 IgG－类风湿因子吸收剂最佳使用量的确定 按照操作程序，样品经IgG－类风湿因子吸收剂处理时，其阳性质控品的A值明显下降，说明特异性IgG存在会影响IgM的测定，而加入IgG－类风湿因子吸收剂可以去除特异性IgG的干扰；当IgG－类风湿因子吸收剂和样品的比例在1∶1时，其效果最佳。比例为2∶1时，和比例为1∶1时效果一致。过少的使用量不能完全去除特异性IgG在IgM测定时的干扰，从而影响测定的效果；相同使用比例下，室温处理30min与2～8℃过夜处理效果一致，均可使用。综合考虑，样品最终稀释比例为1∶102，其模式为：500μL样品稀释液＋10μL样品，取75μL稀释后样品＋75μL IgG－类风湿因子吸收剂（1∶1），室温30min或2～8℃过夜处理。见表2。

2．4 酶标二抗最佳工作时间的确定 从图1可知，酶标二抗的作用时间为30min时，阳性血清A450／630值较大（0．995），且P／N值最大（19．32），因此选择30min为最佳酶标二抗作用时间。见图1。

表1 重组蛋白抗原最佳包被浓度与酶标二抗工作浓度的确定

表2 IgG－类风湿因子吸收剂最佳使用量的确定

图1 不同酶标二抗作用时间时样品的A450／630值

2．5 底物显色时间的确定 酶标二抗作用完成后，加入底物液、底物缓冲液显色，在37 ℃下分别孵育5、10、15、20、25、30 min，加入2mol／L H2SO4溶液终止反应后测定A450／630值，从图2可见显色15min时P／N值最高，可作为最佳显色时间。见图2。

图2 不同底物和底物缓冲液作用时间时样品的A450／630值

2．6 临界值的确定 对500份HPV B19－IgM阴性血清的A450／630值进行频数分布分析，其为0．108，s为0．067，临界值为0．25。

2．7 敏感性试验 检测 HPV B19－IgM阳性血清，当血清1∶600稀释时，检测结果仍为阳性，所建立的方法具有较好的敏感性。

2．8 重复性试验 批内CV均值为3．92%，批间CV均值为4．62%，显示重复性良好，见表3。

表3 重复性试验结果

2．9 临床样品检测 用本试验建立的ELISA方法对1 700份健康献血者血清进行HPV B19－IgM抗体检测，检测结果为阳性的血清27份，阳性率为1．59%；与对照试剂检测结果比较分析，灵敏度为84．60%，特异性为99．70%；符合率为99．47%。对115份孕妇血清HPV B19－IgM抗体检测，检测结果为阳性的血清14份，阳性率12．17%；与对照试剂检测结果比较分析，灵敏度为84．62%，特异性为97．06%；符合率为95．65%，见表4、5。

表4 1 700份健康献血者血清B19－IgM的比较（n）

表5 115份孕妇血清B19－IgM的比较（n）

3 讨 论

B19病毒是一类无包膜的单链线状DNA病毒，其基因组包含5 596个核苷酸，有两个大的开放阅读框，左侧编码NS1非结构蛋白（77×103），右侧编码 VP1（84×103）和 VP2（58×103）两个主要的衣壳蛋白，VP1和VP2组成衣壳包裹在B19病毒DNA表面，构成B19病毒的抗原性，其中96%由VP2组成，VP1仅占4%，B19病毒的主要抗原表位位于VP1独特区和 VP1－VP2链接区［4－5］。虽然 VP1的量比 VP2少，但 VP1大部分片段延伸并暴露在病毒表面，因此更容易与抗体结合，是主要的抗原。VP1独特区能刺激机体产生中和性抗体，成为诊断试剂和疫苗研究的首选区段［6－7］。

本文选用纯化的重组B19病毒VP1蛋白，建立了HPV B19－IgM间接ELISA检测方法，对1 700份健康献血者血清进行HPV B19－IgM抗体检测，检测结果为阳性的血清27份，阳性率为1．59%。与德国维润赛润研发有限公司生产的HPV B19－IgM ELISA试剂盒进行平行比较分析，灵敏度为84．60%，特异性为99．70%，符合率为99．47%。对115份孕妇血清HPV B19－IgM抗体检测，检测阳性血清14份，阳性率12．17%，两种方法有较好的一致性。但其敏感性和特异性稍低，这可能与所用的原核细胞表达系统表达的VP1蛋白空间构象与实际有差异，影响表达蛋白的生物活性。

国外研究报道，B19病毒可通过胎盘垂直传播，可引起孕妇流产、死胎、胎儿非免疫性水肿等症状。在B19病毒感染的流行期，3%～8%的孕妇存在急性感染，胎盘垂直传播率达33%～51%，在受感染的孕妇中约5%～16%胎儿发病或死亡［8］。国内也有研究报道，在对孕早期妇女血清中B19病毒特异性IgM抗体的筛查发现，HPV B19－IgM阳性率为8．1%，明显高于TORCH其他几项病原体的感染率［9］。因此在孕妇及待孕的妇女中开展B19病毒检测，对于提高妊娠质量具有重要意义。B19病毒可通过血液制品传播，且难以灭活，使得经过分离处理的血浆制品仍可能遭受污染，有5%～15%的血浆池不能使用，造成损失，因此在献血者中开展B19病毒检测，对提高血液制品的质量及提高临床输血的安全性意义重大。

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