孙 鸣，马智勇，黄朝阳，胡 斌△，沈关心（1．厦门大学附属第一医院生殖医学科，福建

厦门 361003；2．华中科技大学同济医学院免疫学系，湖北武汉 430030；3．厦门大学附属第一医院检验科，福建厦门 361003）

乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝DNA病毒，是导致人类急性和慢性乙型肝炎的主要原因。目前在乙型肝炎治疗方面，基于RNA干扰的基因治疗成为HBV感染者新的治疗策略［1－5］。但是，如何将siRNA或siRNA表达盒靶向导入 HBV感染的肝细胞是目前应用RNA干扰治疗HBV感染的主要难题之一［6］。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达于HBV感染的肝细胞表面，而未感染的肝细胞不表达此抗原，是HBV基因治疗的良好靶分子［4］。噬菌体展示技术是将外源的重组肽、蛋白质包括抗体片段融合到噬菌体衣壳蛋白上的一项基因技术，是筛选特定分子、细胞甚至组织特异性小分子多肽的有利工具。本研究以HBsAg作为靶物质，应用噬菌体展示肽库技术筛选可以与HBsAg特异性结合的短肽序列，期望以此短肽为桥梁介导siRNA分子结合HBV感染的肝细胞，为乙型肝炎的靶向基因治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料来源 Ph．D．－12TM 噬菌体随机肽库购自 New England Biolabs公司（E8111L），库浓度为1．0×1013pfu／mL，宿主 菌 为 E．coli2738，－96gⅢ 自 动 测 序 引 物 （5′－CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG－3′）由上海生物工程技术有限公司合成。试剂：HRP标记的抗 M13蛋白Ⅷ单克隆抗体（＃27－9421－01，anti－M13phageⅧ，1∶5 000稀释工作浓度）购自 GE healthcare公司。酵母表达的HBsAg由武汉生物制品研究所馈赠。

1．2 方法

1．2．1 噬菌体随机肽库筛选结合HBsAg的特异性多肽 将酵母表达的 HBsAg抗原用0．1mol／L碳酸氢钠（NaHCO3，pH 8．6）包被缓冲液稀释成70μg／mL，每孔100μL包被96微孔板，4℃孵育过夜。倒掉包被液，每孔加满封阻液［0．1mol／L NaHCO3，5mg／mL牛血清清蛋白（BSA），0．02%的 NaN3］，4℃封阻2h。用 TBST（50mmol／L Tris－HCl，150mmol／L NaCl，0．1%Tween－20）快速洗板6次，每孔加入1．0×1011pfu的噬菌体，室温轻摇震荡60min，弃去未结合的噬菌体液，用TBST洗板10次，每孔加入非特异性盐酸甘氨酸洗脱液（0．2 mol／L Glycine－HCl，pH 2．2，1mg／mL BSA）100μL，室温轻摇10min，洗脱特异性结合的噬菌体，收集洗脱液于微量离心管，加入中和缓冲液15μL（1mol／L Tris－HCl，pH 9．1），留取5μL用于滴度测定，剩余洗脱物感染宿主菌ER2738进行扩增，回收后测滴度用于下一轮筛选。以上述方法进行后面3轮筛选，使结合HBsAg的噬菌体克隆得到富集。

1．2．2 特异性结合HBsAg的噬菌体克隆测序 经4轮筛选后，随机挑取15个噬菌体克隆，提取DNA送公司测序。具体操作如下：将单个噬菌体克隆加入1mL ER2738培养物中进行小量扩增，取扩增液500μL，加入200μL PEG／NaCl，混匀，室温放置10min；10 000r／min，离心10min，弃上清液，加100 μL碘化物缓冲液（10mmol／L Tris－HCl，pH 8．0，1mmol／L EDTA，4mol／L NaI）和250μL无水乙醇悬浮沉淀，室温温育10min；10 000r／min，离心10min，弃上清液，用70%乙醇500 μL洗沉淀，再离心去上清液并晾干沉淀，灭菌超纯水30μL悬浮即得高质量的噬菌体克隆DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用肽库－96gⅢ自动测序引物送上海生物工程技术有限公司测序。

1．2．3 ELISA鉴定特异性结合HBsAg多肽的亲和力 用包被缓冲液将HBsAg稀释成20μg／mL，以每孔100μL包被微孔板，密封湿盒中4℃过夜。弃包被液，每孔加满封阻液，4℃封阻2h。0．5%TBST洗板6次，然后按所测定的噬菌体滴度每孔加人5．0×1010pfu的噬菌体，室温作用2h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，再加入 HRP标记的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗体，作用1h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，加入TMB显色液和终止液。以酶标仪读取A450值。同时以20μg／mL BSA 100μL包被微孔板作无关蛋白对照。

1．2．4 剂量依赖结合实验鉴定特异性结合HBsAg多肽的特异性 将HBsAg和无关蛋白m1ECD（小鼠肝脏去唾液酸糖蛋白受体大亚基胞外段）以不同浓度（1、2．5、10、40、70μg／mL）每孔100μL包被微孔板，4℃孵育过夜，并用封阻液4℃封闭2h，0．5%TBST 洗板6次。每孔加入5．0×1010pfu的 No．3号噬菌体和原库，室温作用2h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，再加入 HRP标记的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗体，作用1h，0．5%Tween－20TBST洗板6次，加入 TMB显色液和终止液。以酶标仪读取A450值。

1．2．5 竞争抑制实验鉴定特异性结合HBsAg多肽的特异性 按上述方法用20μg／mL HBsAg每孔100μL包被微孔板。将不同浓度140、70、40、20、10μg／mL 的 HBsAg取100 μL与1．0×1010pfu No．3号噬菌体上清液混匀，室温作用2h。混匀物加入HBsAg包被微孔板内，室温震荡2h，0．5%TBST洗板6次，加入HRP标记的anti－M13phageⅧ（1∶5 000）抗体孵育1h，再用0．5%TBST洗板6次，加入TMB显色液和终止液。以酶标仪读取A450值。

1．3 仪器与试剂 TMB ELISA显色液和终止液购自上海科华生物技术有限公司。其他试剂均为本室配置。主要仪器：高速离心机（Beckman JA－25．50）、低温离心机（Sigma 3－16K）、酶标仪（Thermo multiskan MK3）等。

2 结 果

2．1 特异性结合HBsAg多肽的筛选 以酵母表达的HBsAg作为靶分子，对噬菌体十二肽库进行了4轮筛选，第4轮回收率（回收／投入）比第1轮增加了20倍（表1）。又进行了轮次ELISA鉴定，用ELISA鉴定每轮洗脱物扩增后对HBsAg亲和力的增加，与HBsAg结合的噬菌体得到了有效的富集，见图1。

表1 从噬菌体十二肽库筛选HBsAg结合肽

图1 各轮洗脱物扩增后对HBsAg的结合

2．2 特异性结合HBsAg的噬菌体克隆测序 第4轮筛选完成后，从洗脱物测滴度平板随机挑取15个克隆，提取噬菌体DNA并送测序。结果显示存在9种多肽序列No．1～No．9，其中No．1～No．3为优势序列。见表2。

表2 噬菌体克隆展示肽测序结果

2．3 ELISA鉴定特异性结合HBsAg多肽的亲和力 扩增No．1～No．9噬菌体，以噬菌体ELISA实验检测它们与HB－sAg的结合情况，优势克隆No．3与HBsAg结合最强。结果见图2。

图2 No．1～No．9噬菌体的ELISA鉴定

2．4 剂量依赖结合实验鉴定特异性结合HBsAg多肽的特异性 No．3号噬菌体与HBsAg的结合，随着HBsAg包被浓度的增加而增加，而与无关蛋白m1ECD的结合没有这种剂量依赖性。见图3。

图3 No．3号噬菌体与HBsAg的剂量依赖性结合

2．5 竞争抑制实验鉴定特异性结合HBsAg多肽的特异性游离HBsAg与No．3号噬菌体预先结合后，能够抑制噬菌体与包被HBsAg的结合，且游离HBsAg浓度越高，抑制作用越强。此外无关蛋白m1ECD对No．3号噬菌体与包被的HB－sAg结合没有抑制作用。见图4。

图4 游离HBsAg对No．3号噬菌体与包被HBsAg结合的抑制

3 讨 论

HBV感染是全球重要的公共卫生问题［7］。目前应用于慢性乙型肝炎治疗的药物主要是干扰素和核苷酸类似物，但干扰素因具有明显的不良反应限制了其长期应用，核苷酸类似物停药后易发生病毒DNA的反跳和肝功能异常［8］。本研究室和国内外大量实验表明，RNA干扰（RNAi）可以有效抑制HBV的复制和基因表达，有望成为一种新的HBV感染治疗策略［1－5］。但是化学合成的siRNA和质粒或病毒载体表达的shRNA缺乏肝细胞和肝脏的靶向性，限制了RNAi技术在临床上的应用。如何将siRNA或siRNA表达盒靶向导入HBV感染的肝细胞，是将RNAi技术应用于HBV感染的临床治疗研究必须予以解决的问题之一。目前有多种方法用于细胞靶向的 RNAi，包括细胞表面特异性蛋白的单链抗体（scFv）［4，9］、适配子（aptamer）［10］所介导的siRNA导入，以及配体修饰的纳米颗粒［11］介导的siRNA导入。它们共同点是找到了细胞特异性的蛋白分子，以此分子为靶标，再通过能与靶标分子特异结合的桥梁分子（如单链抗体、适配子等）介导siRNA导入。

小分子多肽具有结构简单、分子量小、穿透性好、不易引起机体免疫应答等优点，可以作为一种良好的桥梁分子，而噬菌体肽库展示技术为筛选具有靶向作用的桥梁分子提供了一种有效的工具［12］。本次技术方案是通过噬菌体肽库展示技术筛选靶向HBV感染肝细胞的靶向性多肽。在靶分子的选择方面刚开始从两个方向考虑，一是HBV表达的蛋白分子，优点是特异性强，但表达丰度低；二是肝细胞表面特异性表达的分子，优点是表达丰度高，但特异性一般。最终选取HBsAg为靶分子，HBsAg表达于HBV感染的肝细胞表面且表达丰度较高，未感染的肝细胞不表达此抗原，是靶向HBV感染的肝细胞最特异的靶分子［13］。本研究以酵母表达的HBsAg作为靶物质，对噬菌体随机十二肽库进行了4轮筛选，第4轮的回收率比第1轮的回收率增加20倍，轮次ELISA鉴定发现与HBsAg结合的噬菌体得到了有效的富集。随机挑选了15个噬菌体克隆进行测序，并用ELISA方法检测各个克隆对HB－sAg的亲和力，结果显示1个展示肽为SSYAPYVWQPIA的优势噬菌体克隆（No．3号）对HBsAg具有较强的亲和力。随后的HBsAg剂量依赖结合实验中No．3号噬菌体与HBsAg的结合随着HBsAg包被量的增加而增加，而与无关蛋白m1ECD的结合没有这种剂量依赖性，表明No．3号噬菌体与HBsAg的结合是特异性的。进一步的竞争抑制实验，先用游离HBsAg与No．3号噬菌体预先孵育后，能够抑制噬菌体与包被HBsAg的结合，且游离的HBsAg浓度越高，抑制作用越强，而无关蛋白m1ECD对No．3号噬菌体与包被的HBsAg结合没有抑制作用，这个结果进一步证明了该噬菌体展示肽与HBsAg结合是特异性的，因此认为十二肽SSYAPYVWQPIA可以作为桥梁分子用于乙型肝炎的基因治疗。

［1］ He F，Chen EQ，Liu L，et al．Inhibition of hepatitis B virus replication by hepatocyte nuclear factor 4－alpha specific short hairpin RNA［J］．Liver Int，2012，32（5）：742－751．

［2］ 张正茂，田拥军，孟忠吉，等．RNA干扰抑制人乙型肝炎病毒复制的研究［J］．中国病毒学，2006，21（4）：348－352．

［3］ Wooddell CI，Rozema DB，Hossbach M，et al．Hepatocyte－targeted RNAi therapeutics for the treatment of chronic hepatitis B virus infection［J］．Mol Ther，2013，21（5）：973－985．

［4］ Wen WH，Liu JY，Qin WJ，et al．Targeted inhibition of HBV gene expression by single－chain antibody mediated small interfering RNA delivery［J］．Hepatology，2007，46（1）：84－94．

［5］蒋霞．乙型肝炎病毒感染的免疫应答及其疫苗的应用［J］．检验医学与临床，2013，10（6）：720－722．

［6］ Chen Y，Cheng GF，Mahato RI．RNAi for treating hepatitis B viral infection［J］．Pharm Res，2008，25（1）：72－86．

［7］ Ganem D，Prince AM．Hepatitis B virus infection－－natural history and clinical Consequences［J］．N Engl J Med，2004，350（11）：1118－1129．

［8］ Hoofnagle JH．Hepatitis B－－preventable and now treatable［J］．N Engl J Med，2006，354（10）：1074－1076．

［9］ Song E，Zhu P，Lee SK，et al．Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell－surface receptors［J］．Nat Biotechnol，2005，23（6）：709－717．

［10］Ni X，Zhang Y，Ribas J，et al．Prostate－targeted radiosensitization via aptamer－shRNA chimeras in human tumor xenografts［J］．J Clin Invest，2011，121（6）：2383－2390．

［11］Hu－Lieskovan S，Heidel JD，Bartlett DW，et al．Sequence－specific knockdown of EWS－FLI1by targeted，nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing′s sarcoma［J］．Cancer Res，2005，65（19）：8984－8992．

［12］Molek P，Strukelj B，Bratkovic T．Peptide phage display as a tool for drug discovery：targeting membrane receptors［J］．Molecules，2011，16（1）：857－887．

［13］Bohne F，Chmielewski M，Ebert G，et al．T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminate infected hepatocytes［J］．Gastroenterology，2008，134（1）：239－247．