基于均匀设计对黄精不定芽增殖培养的研究

2014-10-21周新华肖智勇王丽云陈传松钟文斌钟秋平

安徽农业科学 2014年31期

周新华肖智勇王丽云陈传松钟文斌钟秋平

摘要 [目的]筛选出最适合离体多花黄精不定芽增殖的培养基配方。[方法]以多花黄精带芽根茎为外植体，在激素种类、水平数较多的情况下，采用了均匀设计及其分析方法筛选出最适合黄精不定芽增殖的培养基配方。[结果]最佳培养基配方为MS+KT 1.49 mg/L+NAA 0.29 mg/L+琼脂0.7%+蔗糖3%（pH=5.8），平均增殖系数高达7.09以上。[结论]研究结果为多花黄精规模化、工厂化育苗提供理论和技术支撑。

关键词多花黄精；均匀设计；组织培养；芽增殖

中图分类号 S567 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）31-10909-03

Research on the Rhizome Bud in Vitro Culture Of Polygonatum cyrtonema Hua Based on the Uniform Design Model

ZHOU Xinhua1，XIAO Zhiyong2，WANG Liyun1，ZHONG Qiuping1* et al （1.Experimental Center for Subtropical Forestry， Chinese Academy of Forestry， Fenyi，Jiangxi 336600；2. Yichun City Forestry Research Institute， Yichun，Jiangxi 336000）

Abstract [Objective] The research aimed to select the optimal media formulations of the rhizome bud [Method]Taking the Polygonatum cyrtonema Hua with rhizome and buds as explants，the optimal media formulations of the adventitious bud propagation in the Vitro Culture of Polygonatum cyrtonema Hua was selected by the uniform design and analysis methods under the cases of many hormone kinds and levels.[Result]The results showed that MS + KT 1.49 mg/L+ NAA 0.29 mg/L+Agar 0.7%+Sugar3%（pH=5.8） wsa the best medium for the adventitious buds induction. The average buds number induced by a bud is 7.09. [Conclusion] The research results can provide the theoretical and technical support for the cyrtonema scale and industrialized breeding of Polygonatum cyrtonema Hua.

Key words Polygonatum cyrtonema Hua；Uniform design；Tissue culture；Bud propagation

黄精是以百合科黄精属多年生草本植物滇黄精（P.kingianum Coll.et Hemsl）、黄精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根茎入药，具有补中益气、除风湿、安五脏、久服轻身、延年、不饥、补诸虚、填精髓、平补气血而润的作用^[1-3]。近代研究表明，黄精主要含有糖类、甾体皂苷、强心苷、生物碱、黄酮及蒽醌类化合物、木脂素、维生素、氨基酸及微量元素等化学成分^[4-7]，具有延年益寿、抗菌消炎、抵抗衰老、抗动脉硬化、抗疲劳、提高学习记忆力、调节免疫力、抑制肿瘤细胞等功效^[8-10]。随着研究的深入，人们对黄精的药用价值和保健价值也给予了肯定和认可，黄精原料的市场需求量也越来越大，价格不断上扬，黄精的野生自然资源遭到山区农民的掠夺性采集，使得原本就很稀缺的野生黄精自然资源迅速枯竭，严重影响了黄精植物的可持续开发和利用。因此，为了保证高质量的黄精原料来源，全面推广和实行黄精的产业化种植显得尤为重要。黄精的繁殖方式主要有2种，一种是通过种子繁殖的有性繁殖^[11]，一种是通过根茎繁殖的无性繁殖^[12]。在当前的人工栽培中，由于黄精种子难于收集、发芽率低下、育苗时间过长、时间和经济成本较高，所以在生产上主要是采用根茎繁殖，但根莖繁殖这一方法繁殖系数较低，大规模生产所要消耗种根茎量大，既不经济又限制了黄精产量的潜力，更不便于栽植管理与推广。因此，黄精种苗问题成了推广和实行产业化种植的瓶颈。

获得黄精优质种苗最为有效的途径就是利用植物组织培养技术建立黄精的快速繁殖体系，而快速繁殖体系的关键技术之一在于如何快速高效获得较大的增殖倍数。目前，关于不同激素组合及其浓度对黄精根茎不定芽增殖的组织培养，徐忠传等报道了6BA浓度对离体多花黄精不定芽增殖的影响，认为当6BA浓度为4 mg/L时对黄精根茎芽增殖最为有利^[13]；徐红梅等研究了植物生长调节剂对多花黄精芽外植体发生过程中的性状影响，认为在附加TDZ 1.5 mg/L和2，4D 1.0 mg/L的激素组合对黄精根茎芽增殖最为有利^[14]；刘红美等报道了多花黄精组织培养快繁技术的研究，认为当6BA 4.0 mg/L和2，4D 0.2 mg/L的激素组合最好，对多花黄精不定芽的增殖最为有利^[15]。但在激素种类、激素水平较多时，如何快速高效从中选取最佳的激素组合和浓度的组织培养技术尚鲜见报道，为此，笔者采用由中国数学家方开泰等在1978年提出的均匀设计方法^[16]对黄精不定芽快速增值发生培养基中6BA浓度、KT浓度、IBA浓度以及NAA浓度进行激素种类和浓度选择，找出最佳激素组合和浓度。

1 材料与方法

1.1 外植体材料的处理

试验用材多花黄精带芽根茎采集于江西省分宜县中国林业科学研究院亚热带林业实验中心年珠试验林场大岗山山区。黄精根茎从土中挖出后，洗去泥土，切取带芽根茎，置于洗洁精水溶液中浸泡15 min，再用自来水冲洗60 min以上，然后移至超净工作台上，浸入体积分数为70%的乙醇中30 s，再用质量分数为0.2%的升汞浸泡5 min，立即用无菌水清洗3次以上，将暴露在消毒液中的根茎组织切除，接种于已消毒的各种6BA、KT、IBA、NAA浓度组合的琼脂质量分数为0.7%、蔗糖质量分数为3%、pH为5.8的MS培养基上。

1.2 培养条件

黄精根茎的培养条件为温度控制在（24±2）℃，光照强度控制在1 500～2 000 lx，每天光照时间12 h，培养室湿度保持在70%左右。

1.3 均匀设计

1.3.1 因素和水平数的选定。

选取6BA、KT、IBA、NAA的不同浓度作为参选因素，分别记为A、B、C、D 4个因素，水平数分别选取如下：A代表6BA浓度（mg/L），A1=0.3、A2=0.6、A3=0.9、A4=1.2、A5=1.5、A6=1.8、A7=2.1、A8=2.4、A9=2.7、A10=3.0；B代表KT浓度（mg/L）、B1=0.2、B2=0.4、B3=0.6、B4=0.8、B5=1.0、B6=1.2、B7=1.4、B8=1.6、B9=1.8、B10=2.0；C代表IBA浓度（mg/L）、C1=0.2、C2=0.4、C3=0.6、C4=0.8、C5=1.0、C6=1.2、C7=1.4、C8=1.6、C9=1.8、C10=2.0；D代表NAA浓度（mg/L）、D1=0.1、D2=0.2、D3=0.3、D4=0.4、D5=0.5、D6=0.6、D7=0.7、D8=0.8、D9=0.9、D10=1.0。

1.3.2 均匀设计表的确定。

试验设计时暂不考虑因子间的交互作用，依据中国数学家方开泰等提出的均匀设计方法和均匀设计表^[16]，基于试验设计基本要求，为了科学合理安排A、B、C、D 4个因素，选用U*10（108）均匀表的1、3、4、5列，其偏差D=0.223 6，故得设计表如表1所示。

2.2 逐步回归分析

因为在试验设计时将各因子当做独立因子处理，没有考虑到各因子间的交互作用，所以在对试验结果进行分析时就必须考虑到各因子间的交互作用。由于因子间的交互作用主要是一级交互作用，故在进行逐步回归分析时主要考虑A×B、A×C、A×D、B×C、B×D、C×D的交互作用，即仅考虑二次逐步回归模型，模型的表达式为：

Y=α0+α1·A+α2·A2+α3·B+α4·B2+α5·C+α6·C2+α7·D+α8·D2+α9·AB+α10·A·C+α11·A·D+α12·B·C+α13·B·D+α14·C·D，其中α1，α2，…，α14为待估参数，α0为常数项。根据植物组织培养理论可知，在没有激素的情况下是没有再生芽产生的，也就是说，当A=0、B=0、C=0、D=0时，平均芽数Y=0，由此可知回归模型的常数项α0=0。

虽然模型有14个待估参数，大于试验组数（10），但由于在求解模型时采用了逐步回归分析方法，并非所有的变量均能同时进入模型，只有达到一定显著水平的参数才能入选。故模型可以有少于10个变量的方程入选，使得方程存在一个唯一解，否则误解。

数据分析时使用SPSS数据处理软件对上述模型进行逐步回归分析（检验阀值F1=F2=0.15），逐步筛选变量，入选一个变量进行回归和假设检验，如果显著差异则新进入变量保留，再删除一个变量，进行拟合和假设检验，如果与未删除变量之前差异不显著，则变量删除，依次程序不断增加和删除变量，直到不能再增加和删除变量为止。回归结果表达式为：

Y=6.422D+6.820B-4.405BD-1.857B2。从回归方程及方差分析的结果（表3～4）可以看出，该方程显著性非常明显（F=18.788），F检验的显著性水平P=0.002﹤0.01，相关系数较高（R2=0.962），回归方程可信。D、B、B×D、B×B参数显著性也均是显著的，说明参数效果也很好。综上所述，回归模型能够通过偏相关系数T检验、复相关系数R检验、F检验，说明上述模型合理可信。

2.3 最适培养基的确定

根据回归方程，为了求出Y的最优组合，用微分法dY/dB=6.817-4.302D-3.742B、dY/dD=6.425-4.302B，令dY/dB=0dY/dD=0，求得最优组合为B=1.49、D=0.29，在此基礎上求得最优解Y=7.09。由于求得的方程与6BA（A）和IBA（C）无关，说明6BA、IBA对黄精不定芽的增殖影响较小，故有上面的分析可以得到黄精不定芽增殖培养中最佳激素组合及其浓度为当激素组合KT=1.49 mg/L和NAA=0.29 mg/L，黄精不定芽增殖系数最优Y=7.09个。

2.4 试验验证

按照上述分析得到的最佳组合MS+KT 1.49 mg/L+NAA 0.29 mg/L+琼脂0.7%+蔗糖3%（pH=5.8），参照先前试验程序，将黄精带芽根茎接种到最佳组合培养基上，进行一次验证试验，每瓶接一个带芽根茎，共接30瓶，培养45 d后产生新芽，且长势良好，对无污染的瓶进行统计分析，得平均芽数=总芽数/总瓶数=7.21个，显然，与模型预测值（7.09）相当吻合。

3 结论与讨论

试验结果可以证明，该研究对带芽根茎进行诱导并有新芽产生，培养基MS+KT 1.49 mg/L+NAA 0.29 mg/L+琼脂0.7%+蔗糖3%（pH=5.8）对黄精不定芽增殖培养效果最好，此研究同时也应用了徐忠传等对黄精组织培养的研究结果中的配方^[13-15]进行对照，效果都不如此研究中的好，与报道中的存在差异，可能是因为材料不同和选材时间不同等引起的^[17]。

在植物的组织培养工作中，激素的种类组合及其浓度是影响植物的愈伤组织诱导和植株再生的关键性因素之一，在激素种类较多时，如何用最为高效快速的方法找出最佳激素组合及其浓度，单凭过往经验和用正交设计手段无能为力。该研究中，用正交设计至少得做100组试验，而采用均匀设计仅要10次试验，这节约了试验的时间成本和经济成本，且从此研究采用的均匀设计得到的最佳激素组合及其浓度的验证可以证明效果很好。

通过对多花黄精不定芽增殖组织培养的研究，使用均匀设计及其分析方法是组织培养研究领域中寻找最佳试验方案和配方的有效工具，其不仅大大减少了试验次数且分析准确性好，另外，在电子科技发达的今天已拥有了太多的数据分析软件，为研究者提供了极大的便利，如果在研究工作中广泛应用均匀设计，将会提高研究效率和准确性。该研究应用均匀设计对黄精不定芽增殖培养的数据进行处理和相关分析，在较短的时间内摸索到了最佳配方，得到了较好的结果，对黄精的工厂化育苗及产业化推广种植有一定的参考意义。

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