于晓明　王霞

摘要：本实验利用AFLP技术对这三个玉米自交系的愈伤组织和再生苗进行遗传变异分析。结果发现，H99的再生率最低，并且具有最多的遗传变异；而A188和黄早四的愈伤组织再生率都很高，而且愈伤组织和再生苗的变异较少。说明玉米愈伤组织在组织培养过程中的基因组稳定性是与愈伤组织分化再生过程密切相关。

关键词：玉米；组织培养；遗传变异；AFLP

基金项目：吉林省教育厅科学技术研究项目（吉教科合字〔2012〕第475号）

中图分类号： S513.03；S336 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.051

组织培养诱发的植物体细胞变异（也称植物体细胞克隆变异），一般是指在植物细胞、组织或器官的离体培养状态下发生的遗传变异或表观遗传变异[1]，这些变异可以通过细胞分裂和植物再生而传递给后代。植物体细胞克隆变异的产生没有种属特异性，出现的频率一般比较高，一个组织培养周期内可产生1%～3%的无性系变异，有时甚至能高达90%以上[2]。植物通过体细胞克隆变异，可产生一系列有益的新性状，对植物品种改良和新品种选育具有重要的意义[3]。然而体细胞胚或通过不定芽繁殖的植株经常出现高频率的体细胞克隆变异现象[4，5]，又使其成为微繁和遗传转化工作中需要克服的重大难题。本试验通过AFLP分子标记技术对玉米玉米自交系H99、A188和黄早四在组织培养过程中发生的DNA序列变异的频率和状态进行分析，探讨分析玉米体细胞克隆遗传变异的发生规律。

1 材料和方法

1.1实验材料

玉米自交系黄早四H99、A188和黄早四的种子苗、愈伤组织和再生苗。

1.2组织培养和再生

各玉米自交系在授粉后12天，取幼胚，诱导愈伤组织。诱导培养基：N6基本培养基+2.8克/升脯氨酸+1毫克/升 2，4-D+100毫克/升 水解酪蛋白+10毫克/升 硝酸银+2%蔗糖+0.7%琼脂（pH5.8），于25±1℃条件下，暗培养4周。继代培养基：诱导培养基中添加2毫克/升 2，4-D，暗培养4周。分化培养基：N6基本培养基+1毫克/升 NAA+6%蔗糖+0.7%琼脂（pH5.8），25±1℃、80umol·m-2·s-1光照强度、光照时间为14小时/天的条件下诱导再生苗。待再生苗长至2～3厘米高时取材。

1.3 DNA提取

分别采集种子苗、愈伤组织和再生苗的叶片，用改良的CTAB法[6]提取上述植物材料的基因组DNA。

1.4 AFLP分子标记分析

AFLP分子标记技术主要包括以下几个环节：酶切连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测[7]。使用的限制性内切酶为MseI和EcoRI。

2 结果

2.1 愈伤组织的诱导和植株再生

玉米幼胚接种到愈伤组织诱导培养基上以后，2天后幼胚开始膨胀，6天后就可见到开始生成愈伤组织，以后半个月内都可陆续见到愈伤组织的产生，黄早四的出愈率最低（42%），A188的最高（80%）（见表1）。虽然H99表现出了较好出愈率但是再生率很低，仅为22.9%。

2.2 AFLP分子标记检测的遗传变异

本实验以20对引物分别对各基因型玉米的种子苗、愈伤组织（愈伤）和随机选取的4株再生苗（R1-R4）DNA样品进行了AFLP分析。结果表明A188、H99、黄早四分别产生826，790，904条带，呈多态性的带的条数分别为30，62，38（表2）。

以种子苗作为对照，供体来源相同的愈伤组织或再生植株，表现变异的遗传位点在各个材料中表现并不一致（图1）：其中A188在愈伤组织和再生苗中变异的频率比较接近（1.5%～2.7%）；而H99的愈伤组织检测到了较多的变异（6.2%），4株再生苗的变异相对下降（4.0%～4.5%）；黄早四来源的愈伤组织发生变异比较少（2.5%），而在其再生苗中的检测到的变异更少（0.8%～1.5%）。另外，在A188的愈伤组织和再生苗中检测到的变异中，以条带新增的变异为主，而H99和黄早四的愈伤组织和再生苗的变异条带没有表现出这样的倾向。

3 讨论

在组织培养过程中，为排除由于激素浓度或外部条件的不同或是离体培养时间不同而造成的遗传变异频率的不同，本实验对各个材料均采用一致的诱导、继代、分化培养基和一致的培养条件，并且选择相同培养时间的愈伤组织和再生苗。结果表明，玉米愈伤组织在组织培养过程中的基因组稳定性是与愈伤组织分化再生过程密切相关的，而且不同基因型玉米由组织培养诱导的遗传变异频率有较大差异。本实验结果对于理解不同基因型玉米在组织培养并诱导再生过程中表现出来的巨大差异有很大帮助。

参考文献

[1] Larkin P J， Scowcroft W R. Somaclonal variation - a novel source of variability from cell cultures for plant improvement[J]. Theo Appl Genet，1981， 60：443-455.

[2] Smith M K， Drew R A. Current applications of tissue culture in plant propagation and improvement[J]. Austral. J . Plant Physiol， 1990， 17：267-289.

[3] Bouman H， De Klerk GJ.Somaclonal variation. In： Geneve RL， Preece SE and Merkle SA （eds） Biotechnology of ornamental plants[M]. CAB Int， Wallingford， UK， 1997，165-189.

[4] 肖辉海， 陈良碧. 植物体细胞无性系变异育种[J]， 湖南文理学院学报（自然科学版）， 2003，15（04）：40-46.

[5] 刁现民， 孙敬三. 植物体细胞无性系变异的细胞学和分子生物学的发展. 植物学通报[J]， 1999， 16（04）：372～377.

[6] Moller E.， et al.， A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi， fruit bodies， and infected plant tissues. Nucleic Acids Research， 1992. 20（22）： p. 6115.

[7] 罗洋. 肥料和密度对玉米生长发育及DNA甲基化的影响[D]. 哈尔滨：东北农业大学， 2014.

作者简介：于晓明，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：遗传学与基因工程。