何法霖 高振翔 王 薇 钟 堃 王治国

北京医院卫生部临床检验中心，北京 100730

自1963年利用枯草杆菌抑制试验进行新生儿苯丙酮尿症的筛查以来[1]，经过40多年的发展，新生儿筛查的概念被普遍认可；筛查技术越来越先进，筛查的方法也越来越灵敏、可靠。我国新生儿筛查工作起步较晚，自1980年代起开始进行遗传代谢病的新生儿筛查，1995年将新生儿筛查工作纳入母婴保健法，使开展新生儿筛查工作有了根本保障。但是筛查的病种有限，主要为苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减退症，纳入遗传代谢病较多依赖生化与分子生物学方法，对技术和设备的要求较高，往往是临床诊治难点。随着人类疾病谱的改变和对出生缺陷的重视，近年国际上开展的串联质谱技术检测病种多，可在2 min内检测出45种遗传代谢病，适合大规模遗传代谢病筛查和临床疑似患儿的诊断性检测[2-4]。目前我国越来越多的实验室使用串联质谱开展新生儿筛查工作。鉴于此，卫生部临床检验中心选取了部分开展新生儿筛查的实验室对新生儿遗传代谢病串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱项目进行室间质量评价调查。

1 对象与方法

1.1 室间质量调查对象

2013年选取开展新生儿筛查的实验室19家，为三甲综合医院医院和三甲专科医院临床实验室。

1.2 室间质控品的递送和批号

通过特快专递方式向19家实验室邮寄5个不同批号血斑质控品。质控品由杭州宝荣公司提供，批号分别为 201311、201312、201313、201314、201315。

1.3 样本处理方法及回报结果注意事项

质评物需在2～8℃条件下保存，将质评物当作患者标本进行测定，结果填入对应批号回报表中。回报结果的同时填报使用的测定方法、仪器和试剂名称。

1.4 评价项目

氨基酸包括瓜氨酸（Cit）、亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸 （Met）、 苯 丙 氨 酸 （Phe）、 酪 氨 酸 （Tyr） 和 缬 氨 酸（Val）；酰基肉碱包括游离肉碱（C0）、丙酰肉碱（C3）、异戊酰肉碱（C5）、辛酰肉碱（C8）、月桂酰肉碱（C12）、棕榈酰肉碱（C16）、十八碳酰肉碱（C18）。

1.5 评价标准

2013年参加新生儿遗传代谢病串联质谱氨基酸和酰基肉碱检测项目调查的实验室共19家，实际回报结果的单位为18家，有1家实验室因质控品丢失未回报结果，回报率为94.7%。回报结果按方法学原理（衍生方法和非衍生方法）同时考虑是否是配套试剂分组，以分组后除外x±3s后的中位数作为靶值[5-6]。氨基酸项目评价标准：靶值±25%；酰基肉碱项目评价标准：靶值±30%。

2 结果

2.1 氨基酸和酰基肉碱结果

选取高、中、低浓度的3个批号（201311、201313、201315）分别按照方法学原理同时考虑是否配套试剂分组统计见表1、2。

氨基酸项目按方法分组的统计结果，18家回报结果的实验室有14家实验室采用衍生方法不配套的试剂盒，有3家采用衍生方法配套的试剂盒，只有1家实验室采用非衍生的方法。其中，瓜氨基酸项目的变异系数分布在1.52%～25.01%；亮氨酸项目的变异系数分布在2.93%～24.66%；甲硫氨酸项目的变异系数分布在7.83%～43.00%；苯丙氨酸项目的变异系数分布在1.68%～29.67%；酪氨酸项目的变异系数分布在1.60%～35.09%；缬氨酸项目的变异系数分布在6.62%～52.18%。数据显示实验室检测氨基酸一致性好变异系数基本在40%内。

酰基肉碱的统计结果可以看出，18家实验室中有14家实验室采用衍生非配套的试剂检测酰基肉碱，有3家实验室采用衍生配套的试剂检测酰基肉碱，有1家实验室采用非衍生的方法检测酰基肉碱。其中，游离肉碱项目变异系数分布在4.31%～61.40%；丙酰肉碱项目变异系数分布在5.31%～78.69%；异戊酰肉碱项目变异系数分布在16.29%～64.29%；辛酰肉碱项目变异系数分布在4.81%～80.00%；月桂酰肉碱项目变异系数分布在8.12%～55.56%；棕榈酰肉碱项目变异系数分布在5.75%～34.78%；十八碳酰肉碱项目变异系数分布在3.64%～19.17%。数据显示实验室检测酰基肉碱的一致性不好。

2.2 按方法学分组计算各组及格率

以项目的中位数为靶值，测定值在靶值±30%内判定为及格。氨基酸项目及格率统计结果中瓜氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，亮氨酸项目的及格率为71.4%～100.0%，甲硫氨酸项目的及格率为42.5%～100.0%，苯丙氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，酪氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，缬氨酸项目的及格率为66.7%～100.0%。酰基肉碱及格率统计结果中游离肉碱项目的及格率为42.9%～100.0%，丙酰肉碱项目的及格率为28.6%～100.0%，异戊酰肉碱项目的及格率为33.3%～92.9%，辛酰肉碱项目的及格率为28.6%～100.0%，月桂酰肉碱项目的及格率为46.2%～100.0%，棕榈酰肉碱项目的及格率为64.3%～100.0%，十八碳酰肉碱项目的及格率为71.4%～100.0%。结果表明，各氨基酸项目成绩好于酰基肉碱结果的成绩。

3 讨论

从调查结果看出，串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱大都采用衍生的方法，同时大部分的实验室都没有使用配套的试剂，从本次调查结果看使用配套试剂的3家实验室变异系数较小，但是由于配套试剂的实验室数较少，所以不能说明配套试剂比非配套试剂检测结果更具有一致性。结果还能看出，氨基酸检测结果的一致性比酰基肉碱好，及格率较高，这可能与建立的方法有关。MS/MS与以前大多数筛查实验室所采用的系统是完全不同的技术。它具有多种用途、较复杂的系统，基于疾病筛查的特殊性建立方法时应该注意3个方面[7-9]：①方法的确认，主要是对本室建立的方法进行特异性、重复性、精密度和准确性、线性、干扰实验、基质效应考核。②性能验证，建立方法并确认后，可取一定数量已知含量的样本进行分析，验证方法的准确性，或者通过比对实验来考核。③建立并确认截断值。通过分析正常患者的干血斑标本建立分析物的截断值，同时必须考虑方法和仪器的参数以及可接受的假阳性结果的数量。

表1 各氨基酸按方法分组统计结果

串联质谱检测在遗传代谢病筛查的应用具有很重要的社会效益和经济效益，一次性检测30～50种氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢病等多种疾病，其科学性、临床价值和社会意义有目共睹，而质量控制方面还有待提高。为了保证检验结果一致性，实验室需要做好室内质量控制[10-13]：使用前需优化串联质谱仪自身参数，使其具有较高的分辨率和灵敏度；长时间的关机开机，离子源的喷雾针及进样孔容易堵塞，需要定期检测调试；样品的处理过程也会对检验结果产生很大的影响，比如内标试剂的配制及每次样品吹干时的气流，氨基酸较难溶于甲醇，配制时需超声足够的时间，衍生化的过程可能会导致某些代谢物或内标的降解（如谷氨酰胺脱氨基转化为谷氨酸）；另外，良好的实验环境、严格的实验室管理制度保证工作人员各司其职、重视预防性质控（如优选试验方法、建立操作规程、仪器的调式和校正、试剂的标定、标本的正确处理、遵章操作、准确计算、做好实验记录等）、重视工作人员的业务培训和考核等也有利于保证结果的准确。

表2 酰基肉碱按方法分组统计结果

我国疆域辽阔，地域发展不平衡，实验室的质量控制水平也参差不齐，目前部分发达地区的实验室参加美国CDC的室间质评，并且加强对实验室管理，而一些实验室则只关注新技术新方法却缺乏相关质量控制知识并且未开展实验室间的比对。另一方面，卫生部临床检验中心计划增加串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱的室间质评项目，此举无疑会提高我国遗传代谢病的研究领域整体水平。

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