李江姣 杜慧竟 石继春 徐 苗 叶 强

中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050

肺炎链球菌可以引起肺炎、菌血症、脑膜炎、中耳炎等疾病，是儿童和老年人获得性感染的主要病原菌[1]；接种肺炎链球菌疫苗可以有效预防肺炎链球菌感染[2]。为了保证疫苗质量，所有肺炎链球菌疫苗上市前均需对其免疫保护效力进行测定。目前针对该疫苗，普遍采用的体外效力检测方法是酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），利用抗原-抗体的特异性结合特性对待测血清中的抗体水平进行检测[3]；但该类方法只能检测抗体的总含量，无法将功能性抗体甄别出来，不能真实反映疫苗的免疫保护效果。事实上，对于一些特殊人群，如老年人和免疫系统不完善的人群，接种疫苗后产生的抗体往往是非功能性抗体，不能发挥免疫保护作用[4-5]。可见，如果单纯以抗体含量来评估疫苗质量，很可能无法准确鉴定疫苗的保护效力。因此，迫切需要建立能够准确反映功能性抗体含量的检定方法，以便能够正确评估肺炎链球菌疫苗的保护效力和质量。

肺炎球菌疫苗的保护机制主要是通过特异性抗体介导的调理吞噬作用将体内的肺炎球菌清除。所谓调理吞噬作用是指抗体、补体与吞噬细胞表面结合，促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用。由此可见，注射疫苗后只有机体产生能够有效介导调理吞噬作用的功能性抗体，才能发挥真正的免疫保护作用。通过体外调理吞噬实验 （opsonophagocytic assay，OPA）检测抗体的调理吞噬活性，能够直接反映功能性抗体含量，实现对疫苗保护效力的准确评估[6]。已有多项研究表明，OPA与疫苗临床有效性的相关性要高于ELISA[7-8]。

近年来，国际上多个实验室开始致力于OPA技术的研发，试图建立一套稳定、可靠、标准化的检测方法。美国阿拉巴马大学通过长期探索，建立了优化的多重调理吞噬实验（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同时对4种血清型的肺炎球菌功能抗体进行检测，简化了实验流程，减少了工作量并节约血清样本，提高了OPA技术的检测通量[9]。并且国外部分药企已经开始采用OPA方法进行肺炎链球菌疫苗的临床效力评价[8，10-11]。但由于该方法操作较为复杂，技术要求高，目前国内该方法的研究和应用比较缺乏。本研究参考美国阿拉巴马大学大学的MOPA实验，结合国内的实际情况，旨在建立一套适合我国应用的肺炎链球菌疫苗效力评价方法。

1 材料与方法

1.1 材料

HL-60 细胞系购自美国 ATCC（CCL-240）；13 个血清型的肺炎链球菌菌株（带有特定抗生素抗性）来源于美国阿拉巴马大学伯明翰分校Moon H Nahm实验室；5份血清样本来源于23价肺炎球菌多糖疫苗免疫后的健康人群；SPF级新西兰乳兔（3～4周龄）由中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室提供。

1.2 试剂

BactoTMTodd Hewitt Broth （THB）（批号：3071477）、酵母提取物（批号：2220095）购自BectonDickinson公司；RPMI1640（批号：1393807）、胎牛血清（批号：1428479）购自 Gibco公司； 二甲基甲酰胺 （DMF）（批号：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）（批号：2532B313）购自 Amresco公司；Anti-CD11b PE（批号：2184659）、Anti-CD35PE（批号：2326940）、Anti-CD71 PE（批号：2292633）、Annexin V FITC（批号：2202518）、Propodium Iodide（PI）（批号：SLBB4626V）和 Annexin V Binging Buffer（批号：30435）购自 BD Pharmingen 公司；4 种抗生素：奥普脱欣（Optochin，批号：051M1257V）、奇霉素（Spectinomycin，批号：102K05447V）、甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim，批号：BCBC9232V）、链霉素（Streptomycin，批号：2036B318）购于 Sigma 公司。

1.3 仪器

菌落计数器（型号：ProtoCOL 3）购自英国Synbiosis公司；流式细胞仪（型号：FACS Calibur）购自美国BD公司。

1.4 HL-60细胞的培养及主代细胞库的建立

从ATCC购买的原始HL-60细胞经复苏、增殖培养、再冻存建立一个主代细胞库（80管）。

1.5 HL-60细胞的分化及鉴定

使用DMF诱导HL-60细胞分化5 d，用流式细胞仪进行检测。具体分化步骤及鉴定方法参考文献[12]。

1.6 肺炎链球菌工作种子批的制备及鉴定

1.6.1 肺炎链球菌工作种子批的制备 来源于美国阿拉巴马大学的各型肺炎链球菌，37℃培养过夜后转移至THY液体培养基中继续培养至OD600为0.6～0.9，收集培养液加80%甘油混匀后分装冻存，制备工作种子批。

1.6.2 冻存菌种活力检测 将冻存菌种与未经冷冻的细菌同步稀释后，37℃过夜培养后进行菌落计数，计算冷冻细菌的复活率。

1.6.3 冻存细菌抗生素抗性及敏感性检测 在分别含4种抗生素（奥普脱欣、奇霉素、链霉素、甲氧苄氨嘧啶）的培养基和不加抗生素的对照培养基中，划线接种13个型的肺炎链球菌，37℃培养过夜后进行观察。

1.6.4 冻存细菌工作稀释度的确定 按照参考文献[12]的方法进行工作稀释度的测定。选择菌落数为80～120 cfu/spot的稀释度作为最佳稀释度。

1.7 补体制备及鉴定

取SPF级新西兰乳兔颈动脉采血获得补体，按照文献[12]的方法测定该批次补体的非特异性杀菌率。

1.8 调理吞噬试验

将待测血清在56℃水浴中灭活30 min，按照参考文献[12]的方法进行操作。经菌落计数后，用软件Opsotiter3计算样本的调理吞噬滴度。

2 结果

2.1 HL-60细胞的表面标志鉴定和活力测定

经测定，未分化的HL-60细胞表面标志表达量：CD35为 7.03%，CD71为 88.87%，活细胞比例为88.89%（图1）。HL-60细胞在诱导分化5 d后表面标志表达量：CD35为71.78%，CD71为10.97%，活细胞比例为72.96%（图2）。阿拉巴马大学参考方法的标准规定，分化后活性细胞比例应≥65%，CD35表达应≥55%，CD71表达应≤20%。本实验测得的各项指标均符合阿拉巴马大学参考方法的各项质量标准，可用作OPA实验的效应细胞。

图1 未分化HL-60细胞表面标志表达量及细胞活力检测

图2 HL-60细胞分化后表面标志表达量及细胞活力检测

2.2 肺炎链球菌工作菌种的鉴定

2.2.1 冻存工作种子的复活率 结果显示，13个血清型的冻存肺炎链球菌工作菌种的复活率分别为：1型94%，3型 92%，4型 96%，5型 95%，6A 型 94%，6B型 93%，7F型 91%，9V 型 93%，14型 94%，18C型94%，19A型95%，19F型96%，23F型95%，均高于90%。

2.2.2 工作菌种的抗生素抗性与敏感性检测 结果显示，各型工作菌种均只具有其特定的抗生素抗性，对其余3种抗生素均为敏感。见图3。

2.2.3 工作菌种的工作稀释度确定 13个血清型的冻存肺炎链球菌工作菌种的稀释倍数分别为：1型3333×，3 型 6250×，4 型 2000×，5 型 16666×，6A 型6250×，6B 型 3030×，7F 型 6666×，9V 型 1250×，14 型1250×，18C 型 1470×，19A 型 10000×，19F 型 6250×，23F型6250×，均符合阿拉巴马大学标准中稀释倍数应≥1000的要求。每个血清型对应的稀释条件下，存活的细菌数为80～120 cfu/spot。

图3 肺炎球菌工作菌种的抗生素抗性及敏感性鉴定

2.3 补体的非特异性杀菌率

经计算，制备的补体非特异性杀菌率：1型为7%，3型为9%，4型为35%，5型为1%，6A型为58%，6B型为57%，7F型为12%，9V型为36%，14型为35%，18C型为1%，19A型为5%，19F型为 4%，23F型为47%。符合阿拉巴马大学标准中非特异性杀菌率应≤70%的质量标准。

2.4 血清样本的调理吞噬指数检测

2.4.1 杀菌曲线 5份血清样本的杀菌曲线见图4。图中可见，各血清样本针对各型肺炎球菌的杀菌曲线均为标准的S型曲线。

2.4.2 调理指数 经菌落计数及软件Opsotiter 3的计算，各血清样本的调理指数结果见表1。

3 讨论

图4 5份血清样本针对各型肺炎球菌的杀菌曲线

OPA实验中涉及四个主要元素：效应细胞、靶菌、补体及抗体血清，缺一不可，对于试验的成败都非常重要。本试验中，效应细胞选用的是HL-60细胞株（人早幼粒白血病细胞）。通过悬浮培养，HL-60细胞能持续增殖，人为诱导后可以分化为成熟的中性粒细胞，具有吞噬能力[13]。HL-60细胞在未分化和分化后表面标志物的表达情况会发生变化，如CD71和CD35。CD71蛋白在细胞增殖中发挥重要作用，其表达情况可以指示细胞的增殖状态；CD35是一种跨膜的补体结合蛋白，存在于成熟的粒细胞表面，其表达情况可以显示细胞的分化程度。HL-60细胞未分化之前，CD71的表达量较高，细胞具有较强的增殖能力；分化后CD71的表达量降低，细胞增殖能力减弱，CD35的表达量升高，细胞进入分化后的成熟粒细胞状态。利用流式细胞仪对细胞表面标志物的表达情况进行监测，可以实现对细胞分化程度的判断。HL-60细胞的活性及分化程度越高，吞噬能力越强。

MOPA实验中的靶菌，是带有特定抗生素抗性的各型肺炎链球菌。将靶菌按抗性不同进行分组，每组中的4种靶菌分别携带不同的抗性。利用这一特点，可同时对4种血清型的肺炎球菌进行功能抗体检测。制备工作菌种后，对各型菌种的特定抗生素抗性及敏感性进行确认非常重要。此外，为了保证试验数据的准确性，需要确保对照孔中的活性细菌数在70～180 cfu范围之内；因此对工作菌种的冻存活力及工作稀释度的核实也必不可少。

补体在OPA实验中同样处于重要地位。补体除了与型特异性抗体协作共同参与调理吞噬作用之外，其本身还具有一定的非特异性杀菌能力。如果补体自身的非特异性杀菌力太强，会使特定型别的靶菌被大量杀死，导致试验失败。因此试验中需要先对补体的非特异性杀菌率进行测定，必要时需要对不同批次补体进行筛选。血清样本在试验前需要进行灭活补体的处理，还需要检测是否含有抗生素，从而排除对试验的干扰。血清样本恰当的预稀释倍数十分关键，根据实际情况需要进行调整，如果预稀释倍数太高，容易导致杀菌不彻底，影响试验结果的准确性，而预稀释倍数太低，则容易导致杀菌率太高，无法检出具体的调理滴度。

本研究中，HL-60细胞检测结果显示，分化5 d后活细胞比例为72.96%，CD35的表达量为71.78%，CD71的表达量为10.97%，符合MOPA参考试验的标准要求。工作菌种检测结果显示，工作菌种的冻存活力均高于90%，抗生素抗性与敏感性与预期结果一致，工作稀释度均≥1000，符合标准要求。补体的检测结果显示，非特异性杀菌率均≤70%，符合要求。对5份血清样本的检测结果显示，两平行样本孔间的差异<3倍，杀菌曲线均为标准的S型曲线，符合MOPA试验各项要求。上述结果表明，本研究已经成功建立了MOPA检测方法。

表1 5份血清样本的OPA滴度

OPA技术在国际上已被多个大型制药企业用来进行肺炎球菌疫苗的临床免疫效果评价，WHO也已推荐使用OPA技术进行疫苗的功能性抗体检测[14-15]，OPA技术的应用已然成为肺炎疫苗临床评价领域的一个发展趋势。本研究在中国食品药品检定研究院建立了基于MOPA技术的肺炎球菌疫苗功能抗体检测方法，对于促进国内肺炎疫苗临床评价水平的提高有重要意义。

[1]谭江源，刘俊峰，杨宇，等.327例儿童细菌性肺炎病原体分布及耐药性分析[J].中国医药导报，2013，10（9）：90-91.

[2]Gounder PP，Bruce MG，Bruden DJ，et al.Effect of the 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine on Nasopharyngeal Colonization by Streptococcus pneumoniae——Alaska，2008-2012[J].J Infect Dis，2014，209（8）：1251-1258.

[3]Wernette CM，Frasch CE，Madore D，et al.Enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of human antibodies to pneumococcal polysaccharides[J].Clin Diagn Lab Immunol，2003，10（4）：514-519.

[4]Tarragó D，Casal J，Ruiz-Contreras J，et al.Assessment of antibody response elicited by a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in pediatric human immunodeficiency virus infection[J].Clin Diagn Lab Immunol，2005，12（1）：165-170.

[5]Ortqvist A，Henckaerts I，Hedlund J，et al.Non-response to specific serotypes likely cause for failure to 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine in the elderly[J].Vaccine，2007，25（13）：2445-2450.

[6]Romero-Steiner S，Frasch CE，Carlone G，et al.Use of opsonophagocytosis for serological evaluation of pneumococcal vaccines[J].Clin Vaccine Immunol，2006，13（2）：165-169.

[7]HenckaertsI，DurantN，DeGraveD，etal.Validationofaroutine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children[J].Vaccine，2007，25（13）：2518–2527.

[8]SchuermanL，WysockiJ，TejedorJC，etal.PredictionofPneumococcal Conjugate Vaccine Effectiveness against Invasive Pneumococcal Disease Using Opsonophagocytic Activity and Antibody Concentrations Determined by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay with 22F Adsorption[J].Clin Vaccine Immunol，2011，18（12）：2161-2167.

[9]BurtonRL，NahmMH.Developmentandvalidationofafourfold multiplexed opsonization assay（MOPA4）for pneumococcal antibodies[J].Clin Vaccine Immunol，2006，13（9）：1004-1009.

[10]Yeh SH，Gurtman A，Hurley DC，et al.Immunogenicity and Safety of 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine in Infants and Toddlers[J].Pediatrics，2010，126（3）：e493-505.

[11]Skinner JM，Indrawati L，Cannon J，et al.Pre-clinical evaluation of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine（PCV15-CRM197）in an infant-rhesus monkey immunogenicity model[J].Vaccine，2011，29（48）：8870-8876.

[12]Nahm MH，Burton RL.Protocol for multiplexed opsono phagocytic killing assay （UAB-MOPA）for antibodies against Streptococcus pneumoniae （Version D.05， August 2013） [OL].http：//www.vaccine.uab.edu.2013-08-01.

[13]Fleck RA，Romero-Steiner S，Nahm MH.Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies[J].Clin Diagn Lab Immunol，2005，12（1）：19-27.

[14]World Health Organization.Meeting Report：WHO Workshop on Standardization of Pneumococcal Opsonophagocytic Assay[R].Geneva：WHO，2007：1-19.

[15]World Health Organization.Recommendations for the Production and Control of Pneumococcal Conjugate Vaccines[R].Geneva：WHO technical report series No.927，2005：64-98.