王媛媛 曹 建 邓 莉 陈 勤 欧阳先国

1.南昌市第三医院心内科，江西南昌 330009；2.南昌大学第二附属医院麻醉科，江西南昌 330006

乌司他丁是一种广谱的蛋白水解酶抑制剂，可以抑制体内多种蛋白水解酶的活性，调节炎症细胞因子的释放，减少炎症细胞浸润[1]。研究表明氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、中性粒细胞和细胞凋亡等因素均可能参与心肌缺血再灌注损伤心肌的发病过程[2-3]。本实验检测了乌司他丁对缺血再灌注细胞的心肌组织梗死范围及白细胞介素-6（IL-6）、IL-8的表达，探讨乌司他丁对心肌缺血再灌注损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

取10周左右雄性SD大鼠30只，体重（200±20）g（南昌大学动物实验中心提供），乌司他丁注射液，100 000 U/瓶（广东天普生化医药股份有限公司生产，批号03080806），超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒（武汉亚法生物制品有限公司生产），anti-IL-6、anti-IL-8、小鼠单抗辣根酶标记兔抗山羊IgG、anti-β-actin 山羊单抗（SantaCruz产品）。

1.2 分组及模型制作

30只SD大鼠随机分为3组，分为假手术组、缺血再灌注（I/R）组、I/R+乌司他丁组，每组各10只。假手术组，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。I/R组参考赵秀梅等[4]的垫扎球囊法制作大鼠模型。将充盈的球囊（215 mm×10 mm）垫于冠状动脉前降支与结扎线之间，用力结扎，观察结扎区域变白，局部心肌运动减弱，两个以上导联上出现ST段明显上抬，提示结扎成功。45 min后将球囊快速抽空便可即刻实现前降支血流再灌注（以心电图相关导联ST段明显回落为标准），并持续再灌注3 h。I/R组，结扎冠状动脉后5 min分别通过尾静脉接受静脉注射注射生理盐水，45 min后放松扎线使冠状动脉再通形成再灌注3 h至实验结束；I/R+乌司他丁组结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉注射乌司他丁（50 000 U/kg），其余同 I/R 组。

1.3 生化指标检测

缺血再灌注120 min后自腹主动脉取血6 mL，静置30 min，4℃3000 r/min离心10 min，离心半径为5 cm，分离血清。按照试剂盒说明采用化学比色法测定血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）和MDA、谷胱甘肽（GSH）含量。

1.4 心肌缺血和梗死范围测定

通过 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色将心肌切片梗死区染成灰白色，缺血区染成砖红色，非缺血区染成蓝色，扫描后采用图像分析软件分别计算各部分的面积。缺血的范围用缺血心肌面积与左心室面积之比表示，而梗死范围以梗死心肌面积与缺血心肌面积之比表示。

1.5 Western blot法检测IL-6、IL-8蛋白水平

分别取适量三组大鼠心肌组织，提取总蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS-PAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，洗涤缓冲液（TBST）常温下封闭过夜后，分别加入小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。用 Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MDA、CK-MB水平比较

与假手术组比较，I/R组MDA、CK-MB含量明显增加，GSH含量减少，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；与I/R组比较，I/R+乌司他丁组MDA、CK-MB含量减少，差异有统计学意义（P＜0.05），GSH含量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 三组肌酸激酶同工酶、丙二醛、谷胱甘肽水平比较（±s）

表1 三组肌酸激酶同工酶、丙二醛、谷胱甘肽水平比较（±s）

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.01；与 I/R 组较，#P ＜ 0.05；I/R：缺血/再灌注；CK-MB：肌酸激酶同工酶；MDA：丙二醛；GSH：谷胱甘肽

组别 只数 CK-MB（U/L）MDA（nmol/L）GSH（mg/L）假手术组I/R组I/R+乌司他丁组10 10 10 15.21±6.24 2752.21±1276.36*1873.24±621.43#4.13±3.27 11.13±2.13*8.25±4.26#241.42±3.28 184.26±2.14*202.27±4.38#

2.2 心肌缺血范围和梗死面积

假手术组未见心肌缺血及梗死，I/R组、I/R+乌司他丁组心肌缺血范围分别为（49.72±5.36）%、（51.12±6.24）%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。I/R组梗死面积为（17.12±3.18）%，I/R+乌司他丁组梗死面积为（12.27±4.26）%，两组比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

2.3 心肌组织IL-6、IL-8蛋白表达情况

通过 Western blot法检测各组 IL-6、IL-8蛋白水平，假手术组IL-6、IL-8含量较低，缺血再灌注后，I/R组IL-6、IL-8表达升高，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01），提示缺血再灌注可以诱导炎性因子IL-6、IL-8释放；与I/R组比较，I/R+乌司他丁组炎性因子IL-6、IL-8含量下降，差异有统计学意义（P＜0.05），提示乌司他丁可以减少炎症因子表达。见表2。

表2 三组IL-6、IL-8蛋白表达水平比较（±s）

表2 三组IL-6、IL-8蛋白表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，*P<0.01；与 I/R 组比较，#P<0.05；I/R：缺血/再灌注；IL：白细胞介素

组别 只数 IL-6 IL-8假手术组I/R组I/R+乌司他丁组10 10 10 0.412±0.550 1.785±0.720*1.102±0.780#0.132±0.071 0.926±0.247*0.672±0.240#

3 讨论

乌司他丁能够广谱高效抑制多种炎症因子的释放，是从健康人尿中提取精制的糖蛋白。研究表明乌司他丁对于消除自由基降低炎性介质水平有明显的作用[5-6]。本实验通过检测各项生化指标，I/R组MDA、CK-MB含量明显增加，GSH含量减少，I/R+乌司他丁组MDA、CK-MB含量明显减少，GSH含量增加，提示乌司他丁可能通过增加GSH含量，清除过氧化物代谢，从而减少细胞氧化损伤，对缺血再灌注心肌损伤具有保护作用。

心肌缺血再灌注损伤中，氧自由基的释放及抗氧化酶活性降低，可导致心肌细胞严重受损[7]。同时炎症因子也占有重要地位，心肌早期缺血、缺氧所造成的炎性反应又可促进单核-巨噬细胞大量释放白细胞介素，后者作为一种强特异性的中性粒细胞趋化因子，进一步促进中性粒细胞的聚集，并促使中性粒细胞释放细胞毒性产物，加重炎性反应，损害心肌细胞[8-10]。炎症因子水平的高低和缺血后心脏功能的损害及细胞坏死数量的多少直接相关，说明炎性反应在心肌缺血再灌注损伤中起了非常重要的作用。

IL-8主要由单核巨噬细胞分泌，其他如血管内皮细胞、淋巴细胞等也能产生IL-8。目前，对于IL-8参与心肌缺血再灌注损伤的研究颇多，动物实验发现心肌缺血和缺血再灌注后血中IL-8平均明显升高。IL-6一直以来被认为是参与急性期反应的Th2类细胞因子，实验发现心肌组织IL-6含量在缺血再灌注后有显著性增加[11-14]。本实验通过检测乌司他丁处理后IL-6、IL-8蛋白表达，与假手术组比较，I/R组IL-6，IL-8升高；与I/R组比较，乌司他丁组IL-6，IL-8表达降低，差异有统计学意义（P<0.05），并且CK-MB及心肌梗死面积下降，提示乌司他丁可以通过抑制炎性反应，降低炎症因子表达，减少心肌细胞氧化损伤的途径，减轻心肌缺血再灌注损伤，其机制有待于进一步临床试验论证。

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