王一帆 程明亮 吴君

目前动物实验和人群流行病学调查表明砷对肝脏有致损伤作用，可引起多种肝脏疾病（肝纤维化、肝硬化及肝癌）[1-2]。且临床观察汉丹肝乐对砷中毒致肝损伤有保护作用，初步显示较好疗效[3]。本实验研究汉丹肝乐对砷暴露大鼠肝损伤的保护作用，了解其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为SD大鼠80只，雌雄各半，体重（180～200）g，由贵阳医学院实验动物中心提供。SD大鼠随机分成正常组、模型组、汉丹肝乐高、低剂量预防组，每组各20只。

试剂采用汉丹肝乐（主要成分丹参、赤芍、黄芪、汉防己碱、银杏叶等），棕黄色粉末，贵阳制药厂生产。亚砷酸钠，分析纯，美国sigma公司产品。丙二醛测定试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒、Trizol试剂均购于南京建成生物工程研究所。MT引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-actin引物、逆转录cDNA第一链合成试剂盒、POWER SYBR Green PCR MASTER MIX由美国国家环境卫生科学研究所刘杰博士惠赠。甲醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等均为市售分析纯。实验器材采用GeneAmp9700扩增仪、GeneAmp5700实时荧光定量基因扩增仪、Amersham Biosciences 2100核酸蛋白分析仪、SIGMA-3K30台式冷冻离心机、上海菁华科技仪器有限公司752紫外可见分光光度计、日本三洋-80℃低温冰箱、水浴箱、低速离心机、微波炉等。

1.2 方法 正常组大鼠饮用自来水，模型组、汉丹肝乐高、低剂量预防组饮用亚砷酸钠水，食用普通饲料。亚砷酸钠水浓度，在实验前根据给药方式、大鼠耐受情况，用不同浓度给大鼠饮用，最后选定100/L作为实验浓度。同时，用汉丹肝乐悬液给预防组大鼠灌胃，1次/d，高剂量预防组1g/kg体重、低剂量预防组0.5 g/kg体重。4周后每组大鼠随机处死10只，取肝组织-80℃保存。12周后处死剩余大鼠并留取标本（模型组、汉丹肝乐低剂量预防组各死亡2只）。

1.3 检测指标 按照相应测定试剂盒说明书操作检测肝组织匀浆MDA、SOD;抗氧化系统功能检测;Real-Time quantitative RT-PCR检测MT基因的表达。

1.4 统计学方法 使用SPSS11.5统计软件，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用方差分析，分析前行方差齐性检验，方差齐时用LSD法，若方差不齐时用Tambane’s 法（q’检验），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉丹肝乐预防4周、12周时，各实验组大鼠抗氧化系统受药物的影响如表1、表2所示，汉丹肝乐预防4周，模型组和预防组大鼠肝脏MDA含量与正常组比较有所增加，SOD活性有所减少，但差异无统计学意义（F值分别为1.475,0.228）。汉丹肝乐预防12周，低剂量预防组、模型组大鼠肝脏MDA含量较正常组明显增加（F=5.449，P<0.05），SOD活性明显减少（F=5.432，P<0.05），差异有统计学意义。高剂量预防组大鼠肝脏MDA含量较模型组明显降低（F=5.449，P<0.05），SOD活性明显增加（F=5.432，P<0.05），差异有统计学意义。

表1 第4周各组大鼠肝脏MDA、SOD的变化()

表1 第4周各组大鼠肝脏MDA、SOD的变化()

注：与正常组比较，aP>0.05

组别 例数 MDA（nmol/mgprot） SOD(U/mgprot)正常组 10 2.024±0.634 338.720±49.076模型组 10 2.291±3.028a 322.307±3.028a高剂量预防组 10 2.109±0.824a 312.623±46.092a低剂量预防组 10 2.568±1.091a 332.046±77.858a

表2 第12周各组大鼠肝脏MDA、SOD的变化()

表2 第12周各组大鼠肝脏MDA、SOD的变化()

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

组别 例数 MDA（nmol/mgprot） SOD(U/mgprot)正常组 10 2.16±0.394 374.684±38.732模型组 8 4.551±2.672a 280.844±30.537a高剂量预防组 10 2.163±0.284b 343.38±52.740b低剂量预防组 8 3.759±0.790a 318.35±58.241a

2.2 汉丹肝乐预防4周、12周时，药物对大鼠肝脏MT mRNA表达的影响 如表3、表4所示，汉丹肝乐预防4周和12周,模型组和低剂量预防组大鼠MT-mRNA表达较正常组明显减少，差异有统计学意义（F值分别为16.495，19.917,P<0.05）。高剂量预防组大鼠MT-mRNA表达较模型组显增加，差异有统计学意义（F值分别为 16.495，19.917,P<0.05）。

表3 第4周汉丹肝乐对各组大鼠肝脏MT mRNA表达的影响()

表3 第4周汉丹肝乐对各组大鼠肝脏MT mRNA表达的影响()

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 例数 MT mRNA的相对表达水平正常组 10 91.77±3.67模型组 10 81.17±2.22a高剂量预防组 10 89.75±2.36b低剂量预防组 10 83.23±3.69a

表4 第12周汉丹肝乐对各组大鼠肝脏MT mRNA表达的影响()

表4 第12周汉丹肝乐对各组大鼠肝脏MT mRNA表达的影响()

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 例数 MT-mRNA的相对表达水平正常组 10 80.09±2.27模型组 8 69.6±6.37a高剂量预防组 10 78.18±2.15b低剂量预防组 8 73.43±4.38a

3 讨论

以往研究表明砷有致肝损伤作用。汉丹肝乐通过减少胶原合成及贮脂细胞增殖，抑制脂质过氧化，减轻炎症反应，调节免疫等作用，从而保护肝细胞[4-8]。此实验想了解汉丹肝乐对砷暴露大鼠肝损伤的保护作用，探讨药物保护肝损伤的可能机制。

有研究发现氧化与抗氧化系统参与多种因素（CCL4、砷等）引起的肝损伤[9-10]。砷在体内可以促进自由基的生成，使膜脂质发生过氧化反应，破坏膜结构，从而导致细胞死亡，组织损伤。而当体内自由基增加时，机体会动员抗氧化物质来清除自由基，这样就使得体内的抗氧化物质减少，抗氧化酶活性减低。砷对该系统的影响就是打破了机体氧化与抗氧化系统的平衡。在实验中汉丹肝乐预防4周，高、低剂量预防组MDA含量、SOD活性与模型组比较无明显差异，预防12周高剂量预防组MDA含量较模型组明显减少，SOD活性明显增加，低剂量预防组与模型组比较MDA含量有所减少，SOD活性有所增加但不明显，提示汉丹肝乐对砷暴露大鼠所致的氧化损伤有拮抗作用，此作用可能是通过药物干预氧化与抗氧化系统而产生的。且高剂量预防组表现出的拮抗氧化损伤的作用趋势更大。

金属硫蛋白是一类金属含量高（通常4～12个金属离子/分子）、富含半胱氨酸（20%～30%，有丰富的Cys－X－Cys序列结构域）、缺乏芳香族氨基酸、组氨酸含量极少的低分子量（6000～7000D）金属结合蛋白。研究[11-14]发现MT清除羟自由基的作用是体内目前已知最强的，对肝细胞具有一定的保护作用。实验中我们发现汉丹肝乐预防4周、12周模型组的MT-mRNA表达较正常组明显降低，表明MT可能参与了砷致大鼠肝损伤的过程，有研究[15]显示MT表达的降低可能是亚砷酸钠肝毒性的一个易感因素。低剂量预防组MT-mRNA表达较正常组明显降低，高剂量预防组MT-mRNA表达与正常组水平相当，与模型组比较明显增高，提示高剂量的汉丹肝乐可显著诱导砷暴露大鼠肝脏表达MT-mRNA。MT表达缺乏后，肝脏对化学药物、金属毒物所致肝毒性的敏感性增高，MT表达增多的转基因鼠则可对抗这种肝毒性，提示MT对肝细胞的保护作用[11-14]。汉丹肝乐诱导MT表达后，可能由于MT能有效的减轻肝脏的脂质过氧化反应，减少炎症细胞浸润，炎症介质的释放，干预了肝损伤的发生。

[1]Liu J,Liu YP,Goyer RA,et al.Metallothionein-Ⅰ/Ⅱnull mice are more sensitive than wild-type mice to the hepatotomix and nephrotoxic effects of chronic oral or injected inorganic arsenicals[J].Toxicol Sci,2000,55:460-467.

[2]黎平,刘铭,李达圣,等.燃煤污染型砷中毒临床症状体征分析[J].中国地方病学杂志,2000,19（2）：139-141.

[3]吴君,陆彤,程明亮.汉丹肝乐胶囊对贵州地区20例砷暴露肝损伤患者的治疗作用[J].中国地方病学杂志，2006，25（1）：86-89.

[4]薛惠明,胡义扬,顾宏图,等.丹参抗CCl4和DMN诱导的大鼠肝纤维化[J].中西医结合肝病杂志,1999,9(4):16-18.

[5]Wasser S，Ho JM，Ang HK,et al.Salvia miltiorrhiza reduces experimentallyinduced hepatic fibrosis in rats[J].J Hepatol,1998,29(5):760-771.

[6]杨大国,王林杰，宋为云，等.重用赤芍治疗慢性肝炎肝纤维化前后肝穿刺组织学的比较[J].中国中西医结合杂志，1994，14（4）：207.

[7]范列英,孔宪涛,高春芳.汉防己甲素对大鼠肝细胞、肝星状细胞DNA及胶原合成的影响[J].中国消化杂志,1994,14(5):281.

[8]Ma TF,Hu W,Yu JP,et al.Effects of Ginkgo Biloba extract on liver fibrosis in rats[J].Shuli Yiyaoxue Zazhi,2003,16:396-398.

[9]刘建新,汪秀荣,张文平,等.黄芩苷元对四氯化碳诱导小鼠脂质过氧化反应的影响[J].中药药理与临床,2008,24（1）：25-27.

[10]蒋玲,陆爽,吴君.砷对肝脏的毒性及氧化损伤[J].世界华人消化杂志，2007，15（21）：2334-2336.

[11]Liu J，Liu Y，Hartley D,et al.Metallothionein-I/II Knockout Mice Are Sensitive to Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity[J].J Pharmacol Exp Ther，1999,289(1):580-586.

[12]Kimura T，Fujita I，Itoh N，et al.Metallothionein Acts as a Cytoprotectant against Doxorubicin Toxicity[J].J Pharmacol Exp Ther，2000,292(1):299-302.

[13]Habeebu SS,Liu J,Liu Y,et al.Metallothionein-Null Mice Are More Sensitive than Wild-Type Mice to Liver Injury Induced by Repeated Exposure to Cadmium[J].Toxicol Sci，2000,55(1):223-232.

[14]Liu Y,Liu RA,Goyer W,et al.Metallothionein-I/II Null Mice Are More Sensitive than Wild-Type Mice to the Hepatotoxic and Nephrotoxic Effects of Chronic Oral or Injected Inorganic Arsenicals[J].Toxicol Sci，2000,55(2):460-467.

[15]张韵,吴君,李玲,等.金属硫蛋白基因在长期水砷暴露小鼠肝组织中的表达[J].环境与健康杂志,2007,24（10）：755-758.