商建 邹金艳 伍威 易三凤 张海平 林军

Hedgehog信号通路成员主要包括Hedgehog配体、PTCH受体、SMO受体、转录因子Gli蛋白及位于下游的其他相关信号分子[1]。维生素D3又名烟碱酸胺、胆骨化醇，在钙磷代谢中发挥重要作用。Garland等[2]发现，不同地区的肿瘤发生率与该地区所接受的日照成反比，该差异可能与维生素D3水平有关。近年来有研究报道维生素D3可通过阻断Hedgehog信号通路发挥抗瘤效应[3-5]。本研究应用不同浓度维生素D3干预胰腺癌PANC1细胞系，检测细胞增殖、凋亡及PTCH、Gli-1基因表达的变化，探讨维生素D3通过阻断Hedgehog信号通路抗胰腺癌的作用机制。

材料与方法

一、细胞增殖检测

人胰腺癌PANC1细胞系购自中国科学院上海细胞库常规培养、传代。取对数生长期细胞，接种于96孔板，每孔104个细胞。应用25、50、75、100 μmol/L的维生素D3干预PANC1细胞24、48、72 h，以未加维生素D3处理的细胞作为阴性对照组，以未接种细胞作为空白对照组，每组均设5个复孔。常规培养24、48、72 h，然后每孔加入20 μl MTT溶液，继续孵育4 h，每孔加入100 μl DSMO震荡5 min，上酶标仪检测波长为570 nm处的吸光度值(A570值)，计算细胞抑制率。细胞抑制率=[1-(实验组A570值-空白组A570值)/(阴性对照组A570值-空白组A570值)]×100%。实验重复3次，取均值。

二、细胞凋亡检测

同上述的细胞分组培养24 h，收集细胞。按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

三、PTCH、Gli-1 mRNA表达量检测

同上述的细胞分组培养24 h，收集细胞，同时应用75 μmol/L的维生素D3干预PANC1细胞0、12、24、36、48 h，收集各时间点细胞。采用Trizol提取细胞总RNA。逆转录合成cDNA，然后进行PCR扩增。PCR引物序列：PTCH正义引物5′-TCTCGGATCATTGTGATGGA-3′，反义引物5′-AGGCTCAGCACTAGGCATGT-3′，扩增产物104 bp；……