冯慧 王亚雷 陈熹 张辰宇 袁耀宗 姚玮艳

近年来微小核糖核酸(microRNA, miRNA)在肿瘤的诊断和治疗中的作用越来越受到关注，其中循环miRNA的发现为胰腺癌的早期诊断提供了极大的契机，同时也为研究胰腺癌发生、发展的可能分子机制提供了全新的思路和途径。但是在胰腺癌中，循环miRNA是如何产生、如何稳定存在的，其生物学功能又是什么，这一系列的问题还有待阐明。本研究采用梯度离心法分离人胰腺癌细胞系培养上清、健康人群和胰腺癌患者血清中的微囊泡(microvesicle，MV)，了解细胞培养上清及血清中的MV是否包含循环的miRNA，探讨循环miRNA的载体。

材料和方法

一、血清MV的分离

采集6例病理证实的尚未行手术治疗、放疗及化疗的胰腺导管腺癌患者外周血，以6例同年龄段健康体检者的外周血作为对照组。加入3.8%的柠檬酸钠溶液抗凝后上下混匀，室温1 000 r/min离心10 min后取上层血浆，然后4℃ 300 g/min离心5 min去除残留血细胞，4℃ 1 500 g/min离心20 min去除血小板及其他细胞碎片，4℃ 3 000 g/min离心30 min去除残存细胞器，最后4℃ 110 000 g/min离心70 min弃上清，沉淀即为血清的MV。用500 μl PBS反复吹打溶解后置4℃保存。同时将含有游离miRNA的上清4℃保存。

二、细胞培养上清的MV分离

胰腺癌SW1990、BxPC3细胞系由上海交通大学附属瑞金医院内科实验室馈赠，常规培养，每2～3 d传代。收集细胞培养液，室温1 000 r/min离心5 min后取上清，然后4℃ 3 000 g/min离心30 min，4℃ 110 000 g/min离心70 min弃上清，沉淀即为细胞培养上清的MV。用500 μl PBS反复吹打溶解后置4℃保存。

三、miRNA水平检测

采用酸性酚法提取血清miRNA，采用Trizol(Invitrogen公司)提取细胞培养上清和血清MV中miRNA。应用实时PCR法检测miRNA水平。PCR反……