陈江 牟为民 李宏宇 王迪 郭晓钟

树突细胞(dendritic cells, DCs)是体内功能最为强大的抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APS)，能够刺激并致敏T淋巴细胞，产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lynphocytes, CTLs )，是机体免疫应答的核心。近年来出现的以DCs为基础构建的肿瘤疫苗技术对多种肿瘤均有显著的治疗作用[1-3]。DCs肿瘤疫苗策略为胰腺癌的临床治疗开辟了新的思路[4]。构建肿瘤疫苗的关键在于负载抗原的选择[5]。本研究将人胰腺癌Capan-2细胞总RNA电转染胰腺癌患者DCs，以转染黏蛋白4(MUC4)作为对照，观察其诱导的CTLs对肿瘤靶细胞的杀伤作用，为临床构建胰腺癌肿瘤全抗原DCs疫苗的开发和临床应用提供依据。

材料与方法

一、一般材料及试剂

筛选2012年6月至2014年3月间沈阳军区总医院消化内科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，男性4例，女性2例，年龄35～65岁，平均年龄50岁。全部患者均经组织病理学检查(剖腹探查活检4例，细针穿刺活检2例)证实为胰腺癌。入选前未经放、化疗及免疫治疗。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2、Capan-2、AsPC-1和PANC1由沈阳军区总医院消化科实验室保存；RPMI 1640、小牛血清购自Hyclone公司，重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、rhIL-4、TNF-α 购自PeproTec公司，鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86单抗购自Santa-Cruz公司，鼠抗人MUC4多抗购自Abcam公司，Trizol、 MTT、DMSO、Ficoll淋巴细胞分离液购自Sigma公司，NaCrO4购自中国同位素公司，γ-干扰素(IFN-γ)细胞因子检测试剂盒购自BD公司，Sensiscript RT Kit、T7 mMessage mMachine kit购自Qiagen公司，BCA 蛋白检测试剂盒购自Pierce公司，IFN-γ酶联免疫吸附试剂盒购自Genzyme公司。

二、DCs的分离、培养和鉴定

参照文献[6]方法，通过Ficoll密度梯度离心法分离来自胰腺癌患者100 ml的外周血单个核细胞(PBMCs)，贴壁培养1 h后取出未贴壁的细胞另作培养备用。……