曹佳 李磊 贺思佳 金晶 吴洪玉 徐雷鸣 李兆申

TM4SF1(transmembrane 4 L six family member 1, 也称L6,L6-Ag)是4次跨膜蛋白L6超家族成员[1]，在一些上皮来源的肿瘤，如肺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌等有异常高表达[2-5]。Kao等[6]报道，TM4SF1表达量与肺鳞癌患者的生存期呈正相关。Gordon等[7]报道，TM4SF1/PKM2和TM4SF1/ARHGDIA两组比值与恶性胸膜间皮瘤的术后预后相关。本课题组在前期实验中应用基因芯片对胰腺癌细胞株的mRNA进行筛查，发现绝大多数胰腺癌细胞株的TM4SF1 mRNA表达高于人正常胰腺导管细胞(human pancreatic duct epithelial，HPDE)，提示TM4SF1基因可能与胰腺癌的发生、发展有关[8]。本研究旨在进一步观察TM4SF1对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。

材料与方法

一、细胞株及实验材料

MPanc96、MiaPaCa-2、HPAC、PANC1、AsPC-1胰腺癌细胞系购自ATCC(American Type Culture Collection)。HPDE细胞株由多伦多大学Tsao博士赠送。MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1及AsPC-1细胞株均在含10%胎牛血清、1%抗生素的DMEM培养液中培养、传代；HPAC细胞株在含10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI培养液中培养、传代；HPDE细胞株在含牛垂体抽提物及上皮生长因子 的无血清角化细胞培养液中培养、传代。靶向TM4SF1基因的siRNA(siTM4SF1)及阴性对照siRNA(siNC)均购自QIAgen公司，siTM4SF1序列为5′-AAGGACCACTATGTCTTGATT-3′。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国QIAgen公司。

二、细胞TM4SF1 mRNA表达的检测

三、胰腺癌细胞TM4SF1基因表达的沉默

选取2株高表达的胰腺癌细胞株MPanc96、MiaPaCa-2 的对数生长期细胞，分别接种于10 cm的培养皿中，密度为50%～60%，置37℃培养箱内孵育1 h。在2个EP管中分别加入200 μl OPTI MEM、80 μl Hiperfect、8 μl siRNA(10 μmol/L的siTM4SF1或siNC)混匀，放置室温30 min后分别逐滴滴入孵育1 h的细胞内，继续孵育24 h。应用qRT-PCR方法验证瞬时转染效果。

四、胰腺癌细胞增殖检测

取转染的对数生长期细胞，采用Promega公司的细胞增殖检测试剂盒进行检测。将已转染并孵育24 h的细胞用胰酶消化，用含2%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为1.5×104/ml，接种于96孔板，每孔100 μl。……