黄淑燕 荣俊冬 郑郁善

(1.福建林业职业技术学院，福建 南平 353000；2.福建农林大学工业原料林研究所，福建 福州 350002)

不同产地金线莲组培快繁试验

黄淑燕1荣俊冬2郑郁善1

(1.福建林业职业技术学院，福建 南平 353000；2.福建农林大学工业原料林研究所，福建 福州 350002)

以不同产地金线莲幼嫩茎段为外植体诱导丛生芽，通过不同培养基配方的筛选，建立不同产地金线莲组培快繁体系。结果表明，不同产地金线莲最佳初代培养基分别是，福建永安产地为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，台湾南投产地为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，广西玉林产地为MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT；最佳继代培养基分别是，福建永安产地为MS+2.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA，台湾南投产地为MS+3.0 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA，广西玉林产地为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；在壮苗培养阶段，使用外源添加物蛋白胨后，不同产地金线莲外植体苗的生长状况在不同程度上得到了改善，最佳生根培养基分别是，福建永安产地为1/2MS+1.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ABT1，台湾南投产地为1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，广西玉林产地为1/2MS +0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT1，同时添加1.5 g/L Ac；炼苗移栽基质V(蛭石)∶V(泥炭土)=1∶1，移栽生根率均达90%以上。

金线莲；组织培养；培养基；生长调节剂

金线莲(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl)，为兰科开唇兰属植物，陆生兰，多年生草本，株高4～18 cm，根茎细软，先端直立，基部匍匐状，茎节明显。叶互生，上表面黑紫色，有金黄色脉网，下表面淡紫红色[1]。性喜阴凉、潮湿,尤其喜欢生长在有常绿阔叶林的沟边及林下枯枝落叶层、岩缝、石壁、树兜等土质松散的阴湿环境中，最忌阳光直射。其全草药用，味甘、性平，具有清热凉血、除湿解毒、降血压功效，在我国福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，被称为“药中之王”[2-3]。

金线莲种子自然萌发率和繁殖率低，以分根法或扦插法繁殖,需时长且繁殖系数低,很难形成规模种植[4-5]，近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，导致其野生资源不断遭到破坏性采挖，以致处于濒临灭绝之地，产品一直处于供不应求的状况，市场货源紧缺状况严峻。国内外对金线莲的组培快繁技术已做了较为成熟的研究，但研究主要是针对同一产地外植体快繁体系的构建，而不同产地间金线莲组织快繁的研究报道较少。本研究通过对各产地(福建永安市、广西玉林市及台湾南投县)金线莲组织快繁技术探讨，建立各地金线莲组织组培快繁优化体系并运用其离体器官、组织等培育金线莲种苗，不仅在技术上加快了金线莲的人工栽培，保护其野生资源，稳定市场供应，同时可将省外金线莲更好地引入福建，丰富植物资源，整体上对种质资源保存及药用和观赏园艺种苗提供均具重要意义[5]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外植体源自福建永安市、广西玉林市及台湾南投县的当年生幼嫩茎段，在金线莲母株生长旺盛期剪取，剪取时间为晴天10：00—12：00，取后通风干燥，并置于4℃冰箱中用塑料袋封存备用。

1.2 试验方法

1.2.1培养条件 温度(25±2)℃，湿度60%～70%，光照强度 1 000～1 500 lx，光照周期为光培养12 h，暗培养12 h[6-11]。

1.2.2培养基处理方法 针对金线莲不同部位外植体及培养诱导目的，以MS为基本培养基，添加不同浓度植物生长调节剂组合(细胞分裂素6-BA、KT，生长素NAA、IBA，生根粉ABT1号)及外源添加物(蔗糖、琼脂、蛋白胨Ac等)，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，pH调至5.8，120～125 ℃灭菌25 min[7-9]。

1.2.3各培养阶段试验方案 各培养阶段试验处理号见表1。

表1 各培养阶段试验处理编号

1) 外植体的制备。剪取金线莲野生苗茎段，洗衣粉浸泡15 min，流水冲洗3 h左右，移至超净工作台，用75%乙醇消毒45 s，无菌水冲洗2次，用体积分数为0.1%的升汞+3滴吐温消毒8 min，无菌水冲洗至无泡沫[11]。

2) 启动培养。以MS为基本培养基，分别截取不同产地金线莲1.0～1.5 cm带芽茎段，去除顶芽，接种于添加不同浓度植物生长调节剂6-BA(2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L)，NAA(0.1、0.2、0.5 mg/L)，KT(1.0 mg/L)的培养基中，培养30 d后，根据芽体诱导率(诱导率=诱导芽的外植体个数/接种外植体芽个数×100%)确定最佳植物生长调节剂种类及使用浓度。

3) 继代增殖培养。以启动培养确定的最佳培养方案进行诱导所得的芽体作为外植体，将6-BA与NAA的浓度按10∶1比例进行继代增殖培养30 d后,观察外植体芽体增殖情况及长势,确定最佳植物生长调节剂种类及浓度。

4) 壮苗培养。通过适宜的细胞分裂素及生长素种类及不同的浓度配比，并添加外源添加物蛋白胨，将生长较好的芽分成单株培养，而将一些尚未成型的芽分成几个芽丛培养。

5) 生根培养。以壮苗培养所得芽苗为外植体，以1/2MS为基本培养基，添加1.5 g/L Ac，添加相应种类及浓度的生长素以及较低含量的细胞分裂素，采用4因素3水平的正交试验L9(34)，因子浓度水平及处理见表2。每瓶接种1个丛生芽，重复3次，培养30 d后统计生根率及根系数量，根据结果筛选最佳培养方案。

表2 生根培养正交设计L9(34)

注：括号内为相应水平下植物生长调节剂浓度，单位为mg/L。

6) 炼苗移栽。当根系长度长至4 cm左右，将组培苗从培养室中移至室温下，闭瓶炼苗3 d，开瓶炼苗4 d后，将组培瓶中的带根苗用镊子取出，用蒸馏水洗净根部附着的培养基，植入已用0.1%高锰酸钾消毒过的V(蛭石)∶V(泥炭土)=1∶1基质中[5]，待移栽完成后，浇透水并注意保持湿度及每隔7 d喷洒500倍树大多营养液，移栽30 d后统计成活率。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂配比对芽诱导的影响

将培养15 d及30 d后不同产地金线莲外植体的芽体诱导情况分别进行萌芽数、诱导率统计，结果见表3。

由表3可知，对于3个产地的金线莲，各培养基均能较好地诱导金线莲外植体。福建永安金线莲芽诱导处理均达极显著差异(P<0.01)，其中F1处理诱导率最高，F2其次，F3最低。因此，福建永安产地金线莲的最佳芽诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT；台湾南投金线莲，T1处理芽诱导率最高，T3处理其诱导率高于T2处理，因此，台湾产地金线莲，6-BA与芽体诱导率并不成正比，有一定的使用范围局限性，需进行大量反复试验筛选，本试验以T1：MS+3.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L KT为其芽诱导培养方案；广西玉林产地金线莲，整体诱导率低于其余2个产地金线莲，诱导率与细胞分裂素6-BA浓度成正比，因而，该产地金线莲的芽诱导需高浓度的6-BA，G3：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT为广西玉林产地金线莲最佳芽诱导培养方案。

表3 不同植物生长调节剂配比对金线莲芽诱导的结果

注：不同大写字母者表示差异达0.01显著水平，不同小写字母者表示差异达0.05显著水平；每个处理均接种30瓶。

综上所述，同一植物生长调节剂不同浓度，对同一植物的作用效果不同；同种植物不同产地对植物生长调节剂的要求也不一样，如福建永安金线莲对6-BA的浓度要求低，而广西玉林金线莲6-BA浓度要求最高。

2.2 不同植物生长调节剂配比对芽体增殖的影响

不同植物生长调节剂对金线莲芽的继代增殖结果见表4。由表4可得出，不同产地金线莲，较低含量6-BA与NAA对芽体的增殖均起促进作用，随浓度上升，增殖系数反而下降。采用完全随机试验的DPS软件统计分析得出，各产地金线莲所选定的培养方案分别为福建永安Fy1：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；台湾南投Tn1：MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；广西玉林Gy1：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

2.3 植物生长调节剂及添加物对壮苗培养的影响

植物生长调节剂及添加物对不同产地金线莲壮苗培养的影响结果见表5。外源添加物蛋白胨的添加培养，令金线莲的增殖苗生长状况显著改善，但不同产地金线莲，在该培养基上的生长状况存在一定差异。由表5可知，台湾金线莲长势最好，其次为福建金线莲，广西金线莲未体现出与继代增殖相比的较大的优势。

表4 不同植物生长调节剂对金线莲芽的继代增殖结果

注：不同大写字母者表示差异达0.01显著水平，不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。

表5 外源激素及添加物对金线莲壮苗培养的观测结果

2.4 不同植物生长调节剂对生根培养的影响

植物生长调节剂添加对3个产地金线莲生根培养的测定结果见表6～8。

表6 福建金线莲的生根培养状况

注：不同大写字母表示差异达0.01显著水平，不同小写字母表示差异达0.05显著水平。

表6的生根情况统计表明，产于福建永安的金线莲，上述培养基均能在一定程度上诱导其生根。方差分析结果表明，加入1.5 mg/L NAA获得最高平均生根率75.57%，加入0.5 mg/L IBA获得最高平均生根率75.6%，加入2.0 mg/L ABT1获得最高平均生根率81.1%。因而，对于福建产地金线莲，Fg7：1/2MS+1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ABT1+1.5 g/L Ac生根效果最好，为本次试验中最适宜福建金线莲生根的基本培养基。

表7 台湾金线莲的生根培养状况

表7的生根情况统计表明，产于台湾的金线莲，上述培养基均能在一定程度上诱导其生根。方差分析结果表明，加入0.5 mg/L NAA获得最高平均生根率81.1%，加入0.5 mg/L IBA获得最高平均生根率83.3%，加入ABT1，其使用浓度越高外植体生根率反而降低，所以本次生根试验不加ABT1。由此得出，对于台湾产地金线莲，Tg1：1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+1.5 g/L Ac生根效果最好，为本次试验中最适宜台湾产地金线莲生根的基本培养基。

表8 广西金线莲的生根培养状况

表8的生根情况统计表明，产于广西的金线莲，上述培养基均能在一定程度上诱导其生根。方差分析结果表明，加入0.5 mg/L NAA获得最高平均生根率为72.2%，加入1.0 mg/L IBA获得最高平均生根率为75.6%，加入1.0 mg/L ABT1获得较高平均生根率为71.1%，其使用浓度再升高外植体生根率反而降低。由此得出，Gg2：1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT1+1.5 g/L Ac对于广西产地金线莲生根效果最好，为本次试验中最适宜广西产地金线莲生根的基本培养基。

综上可得，不同产地金线莲具有不同的生理特征，在相同培养基中，其生根效果不同，某一产地的最佳培养基配方不一定是另一个产地的适宜培养基配方，如台湾金线莲最适的试验配方为Tg7，而广西金线莲Gg7却是生根率最低的培养基配方。因而，在不同产地进行金线莲组织快繁研究时，应分别进行相应的大量试验。

2.5 金线莲的炼苗移栽

根据以上的试验得到完整的组培苗，见图1。将金线莲组培苗在闭瓶炼苗3 d，开瓶炼苗4 d后移至户外大棚中，培养30 d后观察试验结果发现，台湾金线莲出瓶苗的成活率高达93.5%，福建及广西2个产地金线莲瓶苗成活率达99%。由此说明,该种培养基质透气保水能力、保温效果等达到了较好程度，基质消毒容易，降低了移栽苗病菌感染率及死亡率。

3 结论与讨论

本研究综合前人对金线莲组织培养的研究结果，设计了以6-BA、NAA、KT、IBA、ABT1为生长调节剂的组织快繁体系，同时，因经过启动、继代2个阶段60 d的培养，芽体长势纤细，茎段节间短，叶子展开不佳，因而根系不易诱导及移栽成活率低，本研究通过外源添加物蛋白胨的添加以改善上述情况，达到壮苗的目的，令金线莲的组培快繁体系更为创新严谨。

通过本研究还得出，不同产地金线莲在相同的植物生长调节剂配比条件下，生长效果不同，在芽诱导时，台湾产地金线莲在芽诱导阶段，需要较高的6-BA浓度，而广西和福建产地金线莲对6-BA浓度要求相差不大。福建产地金线莲对生长素NAA的浓度范围要求相对较高，而广西及台湾金线莲对NAA的要求相对较低；激动素KT在各产地组织培养的芽诱导中均能起促进作用。在外植体继代增殖阶段，适当降低细胞分裂素及生长素浓度同时添加一定量碳粉，有利于金线莲芽体诱导增殖，原因可能在于启动培养获得的无菌芽体相对较嫩，过高的植物生长调节剂易导致切口愈伤组织形成并分化芽，进而影响侧芽分化，最终达不到以芽繁芽目的。在壮苗培养及生根培养阶段，细胞分裂素浓度的使用也在一定程度上降低，目的是为了避免芽体在高浓度植物激素下增殖过快而生长衰退。

[1] 中科院植物所.中国高等植物图鉴：补篇第2册[M].北京:科学出版社,1995.

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(责任编辑 张 坤)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation ofAnoectochilusRoxburghiiin Different Origins

HUANG Shu-yan1, Rong Jun-dong2, ZHENG Yu-shan1

(1.Fujian Forestry Vocational Technical College, Nanping Fujian 353000,China；2.Institute of Industrial Forest, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou Fujian 350002,China)

To obtain the system of tissue culture and rapid propagation ofAnoectochilusroxburghiifrom different origins, the tender stem segments ofA.roxburghiifrom different origins were taken as explant, and screened optimum culture medium formula to induce shoot clusters. The results showed that: the optimum initial mediums ofA.roxburghiiin Fujian, Taiwan and Guangxi was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT, MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT, and MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L KT, respectively. In addition, the optimum subculture medium ofA.roxburghiiin Fujian, Taiwan and Guangxi was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA for, MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA for, and MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA, respectively. In the stage of seedling cultivation, all plants from different producing areas could be improved growth in different degrees after applying exogenous peptone. Additional, the optimum rooting mediumA.roxburghiiin Fujian, Taiwan and Guangxi was 1/2MS+1.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L ABT, 1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA, and 1/2MS+0.5 mg/L IBA+ 1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L ABT1+ 1.5 g/L Ac. Meanwhile, plantlets from test tube grew well on the growth medium of vermiculitethe and peat soil mixed at the rate of 1∶1, the rooting rate of theA.roxburghiireached 90%.

Anoectochilusroxburghii; tissue culture; culture medium; growth regulator

2014-01-06

福建省中药材GAP工程技术研究中心(2008Y2001)资助。

郑郁善(1960—)，男，教授，博士生导师。研究方向：森林培育学和中药材。Email：zys1960@163.com。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.05.012

S723.1

：A

：2095-1914(2014)05-0064-05

第1作者：黄淑燕(1986—)，女，硕士，助教。研究方向：园林植物组织培养和中药材GAP。Email：shuy496@163.com。