唐娟娟

·论著·

虎杖提取物对神经病理性疼痛模型大鼠的镇痛作用研究

唐娟娟

目的研究虎杖提取物对神经病理性疼痛模型大鼠的镇痛作用, 并探讨其作用机制。方法雄性 SD 大鼠, 随机分为对照组和坐骨神经缩狭模型(chronic construction injury, CCI)组。CCI术后14 d, 应用Von Frey法测定机械刺激缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT), 观察口服不同剂量的虎杖提取物对CCI大鼠机械性痛觉超敏的影响。并考察不同剂量虎杖提取物对CCI大鼠脊髓p-ERK、p-P38水平及小胶质细胞活化的影响。结果虎杖提取物可明显升高CCI大鼠术侧的MWT值(P＜0.05), 而对正常大鼠的MWT值没有显著影响(P＞0.05)。同时虎杖提取物可显著抑制CCI模型大鼠脊髓ERK和p38的磷酸化, 并显著抑制IBA-1表达增加。结论虎杖提取物对CCI诱导的机械性痛觉超敏具有显著性的抑制作用, 且镇痛作用维持时间长于吗啡, 其机制可能是通过抑制脊髓水平ERK和p38的磷酸化, 及通过抑制小胶质细胞活化而实现。

虎杖提取物；CCI；神经病理性疼痛；小胶质细胞

神经病理性疼痛是一种由神经系统受到损伤或产生病变而导致的慢性疼痛, 其病理机制十分复杂, 临床上总体疗效不佳, 迫切需要寻找新的镇痛药物。而中医镇痛已有上千年历史, 在中药验方中筛选新的镇痛药物并阐明其作用机制可能为神经病理性疼痛的治疗提供新思路和先导化合物。

中药虎杖为蓼科植物虎杖的干燥根茎。中医认为其利湿退黄, 通常用于血瘀、湿热诸证。能够活血散瘀、祛风通络、清热利湿等, 主治跌打损伤、风湿痹痛等。虎杖的主要生物活性成分由蒽醌类化合物大黄素、大黄酚、芪类衍生物白藜芦醇和多种苷类衍生物等组成。现在药理研究表明, 虎杖提取物具有抑制免疫反应、抗凝、强心、保肝和清除氧自由基等多种作用。有研究提示, 虎杖提取物的抗炎作用, 其作用可能与抑制炎症介质PGE2和NO的产生并抑制细胞免疫有关［1-3］。同时也有文献表明, 虎杖提取物可以通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达来防治痛风性关节炎［4］。

虎杖提取物是否对神经病理性疼痛具有治疗作用, 这方面的研究尚未见报道。本研究制备大鼠坐骨神经慢性压迫模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI), 考察虎杖提取物对神经损伤造成的机械性痛觉超敏的治疗作用并研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1药物 虎杖提取物由中国药科大学临床药学教研室提供, 每克虎杖提取物相当于9.0 g虎杖生药材。盐酸吗啡(沈阳第一制药厂)。

1.2动物 健康成年雄性SD(sprague-dawley)大鼠, 体重为180～220 g, 由浙江省实验动物中心提供, 生产许可证号：SCXK(浙)2008-0033。

1.3仪器 足底测试仪Von-Frey测痛仪CA91367(Woodland Hills公司)；电泳仪(美国Biorad公司)。

1.4统计学方法 结果均以( x-±s)表示, 用SPSS 11.5分析软件进行组间t检验, 行为学、免疫印迹以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1神经病理性疼痛大鼠模型的建立 通过宽松结扎大鼠坐骨神经制备CCI神经病理性疼痛模型。术后14 d测定机械性缩足反射阈值(Mechanical Withdrawal Threshold, MWT),较基础痛阈下降40 %以上者视为CCI模型成功, 可以进行后续实验。

2.2虎杖提取物对CCI大鼠机械性缩足反射阈值的影响筛选CCI造模成功的大鼠, 于手术后第14天开始给药。分CCI模型组, 吗啡组和虎杖提取物治疗组, 虎杖提取物治疗组又分为2.5 g/kg, 5 g/kg和10 g/kg 3个不同剂量组, 每组6只。灌胃给药, 测定给药前0 h和给药后2 h, 4 h, 8 h和24 h的机械性缩足反射阈值。吗啡组椎管内注射1次盐酸吗啡, 剂量为10 μg/只, 注射体积为20 μl/只, CCI模型组则注射相同体积生理盐水, 吗啡组和模型组行为学测定方法同虎杖提取物治疗组。

结果显示：与模型组比较, 虎杖提取物两个剂量单次给药后均具有显著的镇痛作用, 且具有剂量相关性(P＜0.05), 见图1, 同时作用时间维持较长, 镇痛作用＞8 h。而吗啡给药4 h后, 其镇痛基本消失。结果表明：虎杖提取物显著抑制CCI导致的大鼠机械痛觉过敏, 且镇痛作用维持时间显著长于吗啡。

图1 虎杖提取物对CCI模型大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响

2.3虎杖提取物对正常大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响正常SD大鼠18只, 分为溶媒组和虎杖提取物组。虎杖提取物治疗组又分为2.5 g/kg, 5 g/kg和10 g/kg三个不同剂量组,每组6只。灌胃给药, 测定给药前0 h和给药后2 h, 4 h, 8 h和24 h的机械性缩足反射阈值。结果表明, 虎杖提取物三个不同剂量对大鼠的MWT均无显著性影响(P＞0.05), 见图2。

图2 虎杖提取物对正常大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响

2.4虎杖提取物抑制CCI诱导的大鼠脊髓p38MAPK和ERK磷酸化水平的影响 大量证据显示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥着重要作用。利用western blotting 方法, 检测虎杖提取物对CCI诱导的脊髓p38MAPK和ERK磷酸化水平异常升高的影响。

结果显示：CCI模型下大鼠脊髓组织ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平显著增加, 虎杖提取物高剂量10 g/kg可以显著抑制CCI诱导的大鼠脊髓组织的ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平, 而对基础的ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平没有显著影响(P＜0.01), 见图3。

2.5虎杖提取物抑制CCI诱导的大鼠脊髓小胶质细胞活化近年来的研究证实, 小胶质细胞主导的神经炎症和神经免疫反应在神经病理性疼痛的发和维持中发挥重要作用。脊髓水平的IBA-1(小胶质细胞的标记)的表达上调可以作为脊髓小胶质细胞的活化的证据。接下来检测虎杖高剂量10 g/kg干预对CCI导致的脊髓小胶质细胞活化的影响。结果显示：虎杖可以显著抑制CCI导致的大鼠脊髓组织IBA-1水平的上调,同时对基础情况下的IBA-1水平没有显著影响(P＜0.01), 见图3。

图3 虎杖提取物抑制CCI模型大鼠脊髓ERK、p38MAPK的磷酸化, 抑制IBA-1表达上调( x-±s, n=6)

3 讨论

大量的研究表明：小胶质细胞的异常激活在神经病理性疼痛中发挥着重要作用［5］。神经损伤后, 数小时内小胶质细胞即可活化, 并持续数十天以上。活化的小胶质细胞释放大量炎性细胞因子如IL - 1β、IL - 6、TNF-α等, 细胞因子MMP-2/9 以及ATP, NO等活性物质。这个活性物质通过作用于痛觉神经元上对应的受体或信号级联通路, 导致脊髓中枢敏化, 促进和参与维持神经病理性疼痛［6-8］。椎管内给予小胶质细胞的抑制剂米诺环素可以抑制抑制神经损伤导致的机械性痛觉超敏。已经证明, MAPK家族的两个重要成员p38MAPK 和ERK , 尤其是p38MAPK在神经损伤导致的小胶质细胞激活过程中发挥着重要作用。p38MAPK和ERK抑制剂都有报道可以抑制神经损伤导致的脊髓小胶质细胞活化,并减少促炎细胞因子释放［9,10］。

本研究中, 首次发现虎杖提取物有以下功能：①显著抑制CCI导致的大鼠机械痛觉过敏, 且镇痛作用维持时间较长；②显著抑制CCI导致的大鼠脊髓水平ERK和p38MAPK的磷酸化异常性升高；③显著抑制CCI导致的大鼠小胶质细胞异常活化。因此推测虎杖提取物的镇痛作用可能通过抑制脊髓水平的p38MAPK和ERK异常升高, 进而抑制小胶质细胞活化而实现。与研究结果相类似, Tillu及其同事［11］报道虎杖的主要成分之一, 白藜芦醇可通过激活AMPK, 进而抑制感觉神经元中ERK信号通路而发挥镇痛作用。同时研究还发现,两个不同剂量的虎杖提取物均不影响正常大鼠的基础机械学痛阈, 说明虎杖提取物对脊髓水平的正常伤害性感受信息调制没有显著影响。

吗啡类药物被广泛应用于治疗神经病理性疼痛。但是吗啡的镇痛作用持续时间相对较短, 为了有效控制疼痛, 需要持续大剂量给药, 进而带来成瘾, 耐受和胃肠道不良反应等副作用。数据表明, 虎杖提取物虽然在短时的镇痛效率上不如吗啡, 但是其镇痛持续时间显著优于吗啡。10 g/kg虎杖提取物的镇痛持续时间＞8 h, 是5 mg/kg吗啡的2倍以上。这表明以虎杖作为研究目标, 从中寻找新的镇痛药物具有较大潜力。

［1］ 徐新, 李德明, 徐佳薇, 等.虎杖提取物的抗炎作用及对一氧化氮生成的影响.中国医院药学杂志, 2013, 33(016):1311-1315.

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［3］ 王斌, 侯建平, 李敏, 等.虎杖提取物对急性痛风性关节炎大鼠血清PGE-2的影响.中国中医基础医学杂志, 2009, 14(12): 944-945.

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［5］ Lewis S.Pain: microglia take control in chronic pain.Nat Rev Neurosci, 2013, 14(3): 154-155.

［6］ Meulders A, Vlaeyen JW.Fear reduction in subacute whiplashassociated disorders: the royal road to recovery? Pain, 2013, 154(3): 330-331.

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［9］ Piao ZG, Cho IH, Park CK, et al.Activation of glia and microglial p38 MAPK in medullary dorsal horn contributes to tactile hypersensitivity following trigeminal sensory nerve injury.Pain 2006, 121(3):219-231.

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［11］ Tillu DV, Melemedjian OK, Asiedu MN, et al.Resveratrol engages AMPK to attenuate ERK and mTOR signaling in sensory neurons and inhibits incision-induced acute and chronic pain.Mol Pain, 2012(8):1-12.

Analgesic effect of polygonum cuspidatum extract in rat model of neuropathic pain

TANG Juan-juan.
Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

ObjectiveTo study the analgesic effect and mechanism of polygonum cuspidatum extract in the neuropathic pain using rat chronic constriction (CCI) mode.MethodsThe SD rats were randomly divided into control and model groups.After 14 days of CCI, we observe the effect of different doses of polygonum cuspidatum extract on rat mechanical allodynia using vonFrey flinching reflex threshold (mechanical withdrawal threshold, MWT), The levels of p-ERK, p-P38 and the activation of microglial cells in rat spinals were measured by Western blotting.Resultspolygonum cuspidatum extract can significantly increase the value of MWT in CCI rats (P＜0.05), whereas had no significant effect in normal rats (P＞0.05).Meanwhile, polygonum cuspidatum extract significantly inhibited the phosphorylation of ERK and p38, and inhibited the expression of IBA-1 in CCI rat.ConclusionPolygonum cuspidatum extract can inhibit the mechanical allodynia in CCI rat, and the duration is longer than the analgesic effect of morphine.The mechanism may be associated with the inhibition of the phosphorylation of ERK and p38, and inhibition of microglial cell activation in rat spinal.

Polygonum cuspidatum; CCI; Neuropathic pain; Microglial cell

210023 南京中医药大学生理学教研室

唐娟娟 E-mail：tangjuanjuan5njmu@126.com