郭萍，武瑶，李嘉,3，方荣祥，贾燕涛

1中国科学院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室，北京100101 2中国科学院大学，北京100049 3北京城市学院，北京100083

利用水稻原生质体快速分析m iRNA靶标RNA

郭萍1,2，武瑶1，李嘉1,3，方荣祥1，贾燕涛1

1中国科学院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室，北京100101 2中国科学院大学，北京100049 3北京城市学院，北京100083

与转基因方法相比，基因瞬时表达系统在基因表达研究上具有快速便捷的特点。为检验水稻m iRNA与靶标基因之间的调控关系，将MIRNA基因与GFP/靶标序列融合基因(或GFP/靶标突变序列融合基因)构建在同一瞬时表达载体上，并转化水稻原生质体，通过观察含有GFP/靶标序列融合基因和GFP/靶标突变序列融合基因的载体之间的荧光强度差异，以及通过qRT-PCR方法检测靶标和非靶标mRNA水平差异来验证m iRNA对靶标基因的调控。用osaM IR156和osaMIR397及其靶标序列对实验设计方法进行验证，荧光显微观察和qRT-PCR检测证明，osam iR156和osam iR397能降低相应靶标序列GFP融合基因的转录物水平和GFP荧光水平。此种水稻原生质体瞬时表达方法用于在体内进行大规模m iRNA靶标基因检测。由于其他近缘单子叶植物很可能与水稻有近似的小RNA加工系统，因此对于其他单子叶植物m iRNA功能研究也将有很好的应用前景。

m iRNA靶标，水稻原生质体，体内荧光检测

越来越多的证据表明，非编码小RNA (Non-coding small RNA)广泛存在于动物、植物及微生物中，作为一类新层次上的基因表达调控物质对生物的生长发育等多种生理过程具有重要作用。植物内源非编码小RNA主要分为m iRNAs(M icroRNAs)和siRNA(Short interfering RNAs)，siRNA又分为反义转录物siRNA(Natural antisense transcript siRNA, nat-siRNA)、反式作用siRNA(Trans-acting short interfering RNAs,tasiRNAs)、异染色质siRNA (Heterochromatic siRNAs)和长siRNA(Long siRNA,lsiRNA)等。它们可以通过对靶标mRNA的剪切或翻译抑制，以及对DNA或染色体的甲基化等方式调控靶标基因的表达[1]。非编码小RNA像可变电阻一样，能够精细调控众多基因的表达水平，对生物体的生长发育和功能至关重要。基因芯片分析发现，在高等真核生物中受m iRNAs调控的基因就多达50%[2]。

M icroRNAs是一种约21−23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70−90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。在秀丽线虫中m iRNA lin-4和let-7被首次发现，随后在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴定出数百个m iRNAs[3-4]。成熟的miRNAs进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，并作用于靶标RNA的特定靶位点，这些靶位点通常位于mRNA的3′-UTR区(Untranslated region)或CDS区(Coding regions)，引起靶标RNA的剪切或者翻译抑制[5]。一个m iRNA与靶标基因只需要部分序列匹配就能完成两者之间的识别，这种m iRNA与靶标基因的匹配程度的可变性，使得一个m iRNA可能与多个靶标互作，而一个靶标也可能与多个m iRNA互作。植物中保守的m iRNA，其在不同物种之间的靶标基因也常存在保守性；但不同物种中也存在特异的、非保守的m iRNA靶标序列[5]。目前，挖掘m iRNA新靶标的方法主要是通过生物信息学预测和生物学实验获得。由于m iRNA与靶标序列为不完全匹配，这对m iRNA靶标预测的准确性构成很大挑战；而基因克隆、基因芯片和深度测序等方法对发现低丰度和不同时空表达的靶标基因有一定困难。如果利用计算机预测结合实验验证的方法，两者取长补短，将大大加速研究进程。

当m iRNA进入RISC复合物，复合物核心成分AGO蛋白(A rgonaute proteins)行使对靶标RNA的切割功能。AGO蛋白在距离m iRNA 5′端第10−11位核苷酸相应位置对靶RNA链进行精确切割，产生5′磷酸和3′羟基的切割产物，这一特性被用于检测mRNA是否为m iRNA的靶标[6]。常用的检验m iRNA靶基因的方法有农杆菌注射法和5′RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法。农杆菌注射法是将含有m iRNA及靶基因载体的农杆菌注射接种植物叶片，检测m iRNA对靶基因的剪切效果[6]；5′RACE法是直接分析miRNA剪切的产物，把接头连接到m iRNA剪切产物的5′末端，经RT-PCR和测序，精确鉴定m iRNA的切割位点[6]，也是目前m iRNA靶基因鉴定中最广泛采用的方法。农杆菌注射法鉴定m iRNA靶基因与通过转基因植物鉴定方法相比，因其具有简单、快速的特点而在双子叶植物中得到广泛应用。水稻等单子叶植物以农杆菌注射法成功鉴定m iRNA靶基因尚未见到相关报道。

本实验中将花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的内源m iRNA序列，与35S启动子驱动的3′末端融合m iRNA靶标序列(或m iRNA靶标变异序列)的GFP基因串联到pBI221载体，以PEG(聚乙二醇)法转化水稻原生质体，通过GFP荧光强度比较发现，含有m iRNA靶标序列载体与含m iRNA靶标变异序列载体存在差异，说明m iRNA能够有效识别并干扰RNA靶标基因的表达，Real-time PCR实验验证了该结果。该方法是一种快速有效验证m iRNA的靶标的方法，对于研究水稻m iRNA的功能具有实用意义。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、培养基及植物材料培养

大肠杆菌DH5α、BL21(DH3)菌株为本实验室收藏。用于基因瞬时表达的pBI221-eGFP、pCAMBIA 1300质粒为本实验室收藏。常规LB培养基配制参见文献[7]。水稻日本晴(Oryza sativa L.var.Nipponbare)种子浸水萌发后播种于土中(蛭石∶泥炭土=1∶1)，光照培养(光/暗周期为16 h/8 h)。

1.2 主要试剂和仪器

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T载体和质粒提取试剂盒购自Promega公司；无缝克隆试剂盒购自GenBank Biosciences公司；TRIzol试剂、逆转录酶购自Invitrogen公司；poly(A)聚合酶和FirstChoice®RLM-RACE试剂盒购自Ambion公司；纤维素酶R-10和离析酶R-10购自日本Yakult公司；实时定量PCR试剂盒购自TOYOBO公司。Ambion PCR引物由Invitrogen公司合成。实时定量qPCR使用BioRad C1000荧光定量PCR仪，荧光观察所用仪器为徕卡公司激光共聚焦显微镜(型号Leica SP8)。

表1 本文所用的引物Tab le 1 Prim ers used in this work

1 5 6 -F G G G A A T G A T G T A G C A C G G 1 5 6 -R T C A G G A A T T A C G A A G G G T G B I 1 5 6 -F G A A C A C G G G G G A C T C A C G G G A A T G A T G T A G C A C G G B I 1 5 6 -R G A A A T T C G A G C T G C A C T C A G G A A T T A C G A A G G G T G M G F P -F G A A C A C G G G G G A C T C T A G A G s p l -R -2 G G G A A A T T C G A G C T C A T G A C A G A A G A G A G A G A G C A C A G C T C G A G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C A s p l m -R -2 G G G G A A A T T C G A G C T C A G G A G A G C A G G G A C A G G G C G C A G C T C G A G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C A 3 9 7 -F T C C A G A G C G C A C A C T A T T 3 9 7 -R T G A G T T G C T G C A T T G T T G T B I 3 9 7 -F G A A C A C G G G G G A C T C A C T C C A G A G C G C A C A C T A T T B I 3 9 7 -R G A A A T T C G A G C T G C A C T G A G T T G C T G C A T T G T T G T l a c -R G G G G A A A T T C G A G C T C T A G T T G A G T G C A G C G T T G A T G A G C C T C A G C A T G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C l a c m -R G G G G A A A T T C G A G C T C T A G T T T A A A G C T G C A T T T A T C A G T C T C A G C A T G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C P o l y ( T ) a d a p t e r G C G A G C A C A G A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G ( T ) 1 2 V N R P G C G A G C A C A G A A T T A A T A C G A C g f p q r t A C G A G C T G T A C A A G T C C G G m i R 1 5 6 -F T G A C A G A A G A G A G T G A G C A C m i R 3 9 7 -F T C A T T G A G T G C A G C G T T G A T G a c t i n -F T G T A T G C C A G T G G T C G T A C C A a c t i n -R C C A G C A A G G T C G A G A C G A A

1.3 质粒的构建

对pBI221-eGFP质粒进行改造，将35S启动子分别驱动的m iRNA基因和3′端融合相应m iRNA靶标序列的GFP基因构建到同一载体上。首先用Ter-F和PML-R，35S-R和PML-F为引物，以pCAMBIA1300-221质粒(pBI221经Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切的小片段插入pCAMBIA1300的Hin dⅢ/Eco RⅠ位点)为模板，扩增Nos-T终止子和35S启动子片段，将两个PCR片段和经Eco RⅠ/Hin dⅢ酶切的pCAMBIA1300载体大片段进行无缝连接，得到质粒pCAMBIA-PML，使pCAMBIA1300-221质粒中删除GUS基因，同时添加Pm lⅠ酶切位点。用BLG159F/R引物，以质粒pCAMBIA-PML为模板进行PCR扩增，使35S启动子5′端和终止子3′端加上AatⅡ和NdeⅠ的酶切位点，并克隆到T载体，得到质粒T-PML。T-PML经AatⅡ和NdeⅠ酶切片段插入pBI221-eGFP载体AatⅡ/NdeⅠ酶切位点，得到本实验用的载体pBI221-PML。

从miRBase数据库中检索到水稻osaMIR156的序列信息(http://www.m irbase.org)，用156F/R引物从水稻基因组中扩增osaM IR156的全长基因，以此PCR产物为模板，用BI156F/R引物再次扩增，使PCR片段加入15 bp的pBI221-PML载体序列，回收PCR产物与pBI221-PML的Pm lⅠ酶切大片段无缝连接，得到pBI156载体。

以pBI221-eGFP质粒为模板，用引物MGFP-F和含有osam iR156靶标序列的引物spl-R-2进行PCR扩增，去除GFP的ORF终止密码子，并使其3′端融合靶标序列得到GFPspl，回收GFPspl片段并与pBI156的Bam HⅠ/SacⅠ酶切产物进行无缝连接，得到pBI156spl载体。同样的，用引物MGFP-F和splm-R-2扩增得到GFP和突变靶标基因序列融合序列，即GFPsplm，将其与pBI156的Bam HⅠ/SacⅠ酶切产物进行无缝连接，得到pBI156splm载体。

与上述构建方法相似，用397F/R引物扩增出osaMIR397基因的全长序列，再用BI397F/R引物使扩增片段延长后与pBI221-PML的Pm lⅠ酶切产物无缝连接，得到pBI397载体。

以pBI221-eGFP质粒为模板，用MGFP-F和lac-R引物扩增，将osam iR397靶标序列与GFP融合，得到GFPlac片段，MGFP-F和lacm-R引物扩增，将osam iR397靶标突变序列与GFP融合，得到GFPlacm片段；回收这两个片段，分别与pBI397载体的Bam HⅠ/SacⅠ酶切产物进行无缝连接，得到载体pBI397lac和pBI397lacm。

1.4 原生质体的制备

采取酶解的方法制备原生质体[8]。取生长约18 d的日本晴水稻小苗的茎部，用刀片切成0.5 mm细圆片；将圆片移入10 m L酶解液中，酶解液主要成分为1.5%纤维素酶R-10，0.75%离析酶R-10，0.4 mmol/L D-甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES[2-(N-吗啉)乙烷磺酸，pH 5.7]，10 mmol/L CaCl2，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.1%BSA；过滤除菌，加入羧苄青霉素至终浓度50 μg/m L，28℃，50 r/min避光振荡消化4 h；过滤网(200目)过滤酶解液，以50 m L的离心管收集液体，150 r/m in， 5 m in离心沉淀原生质体(设置最低的加速度)；移除上清液，加入W 5缓冲液[154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl,2 mmol/L MES，pH 5.7)]，轻轻颠倒试管洗涤沉淀，150 r/min离心5 m in沉淀原生质体，弃上清液。

1.5 原生质体的转化

将制备的原生质体用MMg溶液(4 mmol/L MES，0.6 mol/L甘露醇，15 mmol/L MgCl2)重悬至原生质体的终浓度约为106个/m L。100 μL原生质体中加入质粒载体约20 μg，混匀后加入110 μL 40%PEG溶液(0.6 mol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2,40%V/V PEG4000)溶液，混匀后于28℃孵育15 m in；加入2 m L W 5缓冲液，颠倒混匀；150 r/m in离心3 m in，离心沉淀原生质体，弃上清；用500 μL W 5缓冲液重悬原生质体，28℃避光静置过夜。

1.6 GFP荧光显微观察

原生质体经质粒转化10–12 h，利用激光共聚焦显微镜进行观察并统计荧光强度。将500 μL原生质体最小加速度150 r/m in离心3 m in，吸取并弃掉450 μL上清，重悬原生质体，每次吸取10 μL原生质体悬液进行显微观察，用10×物镜(数值孔径NA为0.4)观察，多线氩离子激光器激发，激光能量20%，激发波长为488 nm，发射波长为500−600 nm；光电倍增管检测器检测荧光信号，增益值800；图像扫描密度1 024×1 024，扫描速度200 Hz。利用LAS AF Lite软件统计每个视野荧光通道的平均灰度值[(灰度值总和−背景灰度值)/计入测量的像素数]，作为表征视野内发光细胞荧光强度的一个参数，将其除以原生质体细胞总数，得到原生质体细胞的平均相对荧光强度。

1.7 RNA的提取和实时定量PCR分析

原生质体经质粒转化后8–10 h，150 r/m in离心3 min，吸取并弃掉450 μL上清，加入500 μL TRIzol，混匀室温静置5 m in，加入100 μL三氯甲烷，混匀室温静置5 m in，4℃，12 000 r/m in离心15 min；吸取300 μL上清加入250 μL异丙醇和1 μL糖原，−20℃沉淀过夜；4℃，12 000 r/min离心45 m in沉淀RNA，70%的酒精清洗沉淀，离心5 m in，弃上清，室温晾干5 m in，用适量无RNase水溶解沉淀。

RNA的加尾和逆转录操作参考Shi等的工作并稍做改动[9]。取1 μg的总RNA经DNaseⅠ消化后，在逆转录酶的工作缓冲液中加入poly(A)聚合酶和ATP，37℃反应1 h，使RNA 3′端加上poly(A)尾巴；65℃5 m in，待反应产物降至室温，加逆转录酶(SuperScript™ⅡReverse Transcriptase)和0.5 μg poly(T)adapter (3′RACE adapter in FirstChoice®RLM-RACE kit)进行逆转录反应。

以上述逆转录产物为模板进行qPCR定量，osamiR156的PCR扩增引物为m iR156-F和RP，PCR产物大小64 bp；osam iR397扩增引物为miR397-F和RP，PCR产物大小65 bp；GFP基因扩增引物为gfpqrt和RP。使用TOYOBO SYBR Green(Realtime PCR Master m ix)试剂盒：20 μL体系中加0.5 μL cDNA模板，1 mmol/L正向引物，1 mmol/L反向引物。反应条件：95℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环反应。

2 结果

2.1 瞬时表达载体的构建

为在水稻原生质体中检测miRNA是否能够剪切其靶标基因，我们采取了将m iRNA基因和靶标基因串联表达在同一个植物表达载体中的策略，两者均由35S启动子驱动。为了便于观察m iRNA对靶标基因的作用效果，我们将与miRNA互补配对的含有靶标基因序列与去除终止密码子的GFP基因3′端融合，如果m iRNA能够剪切靶标mRNA，则与靶标重组的GFP(称为GFPc基因)也能被剪切。同时突变靶标基因序列，在不改变其氨基酸序列的前提下使之不与miRNA互补配对，再与GFP基因序列融合重组成不可被剪切的GFPnc基因，作为GFPc基因的对照。将GFPc基因和GFPnc基因分别同相应的miRNA共同在水稻原生质体中瞬时表达，通过比较GFPc基因和GFPnc基因的表达水平，判断特定miRNA和其候选靶标基因的调控关系。本实验挑选水稻osam iR156和osamiR397及其相应的靶标基因作为验证对象，以检验在水稻原生质体中检测m iRNA靶标基因的方法是否可行。以往的实验已证实水稻osam iR156可以靶向剪切OsSPL14基因的转录产物从而影响水稻的株型[10]；osamiR397的靶标则是水稻的类漆酶基因OsLAC，该基因影响水稻种子大小和花序分支，对水稻产量有重要影响[11]。如图1所示，osaMIR156与其相应的GFPc和GFPnc基因分别共表达的载体是pBI156spl和pBI156splm，而osaMIR397对应的载体则是pBI397lac和pBI397lacm。

2.2 显微观察蛋白水平差异

将pBI156spl和pBI156splm转化水稻原生质体，静置培养12 h后，在激光共聚焦显微镜下观察GFP荧光强度。如图2(A，D)所示，在相同的转化及培养条件下，pBI156spl、pBI156splm、pBI397lac和pBI397lacm四种质粒转化的原生质体都能被激发绿色荧光，说明增加的后缀序列并未改变GFP蛋白的荧光特性。每种转化原生质体的观察样品随机选取10个视野进行拍照，统计总的细胞数目、发光的细胞数目以及细胞的发光强度。如图2B所示，统计结果表明，pBI156splm载体转化的原生质体平均发光率(发光细胞数/总细胞数)达到39%，是pBI156spl载体转化的原生质体平均发光率(14%)的2.8倍。pBI156splm载体转化的原生质体的平均相对荧光强度达6.25×10−3，多于pBI156spl载体转化的原生质体的平均相对荧光强度1.73×10−3，二者存在明显差异(P<0.01，图2C)。同样，pBI397lacm载体转化的原生质体的平均发光率和平均发光强度分别是31%和5.06×10−3，都明显大于pBI397lac载体转化的原生质体的平均发光率和平均发光强度(分别是18%和2.41×10−3)(P<0.01，图2E，2F)。说明通过水稻原生质体GFP荧光观察可以判断m iRNA和其候选靶标基因的调控关系。

图1 瞬时共表达m iRNA和融合靶标序列的GFP基因载体构建图谱Fig.1 Schematic diagram of constructs for coexpression of m iRNA and GFP gene fused w ith target sequences.

图2 原生质体中GFP显微荧光观察及定量统计Fig.2 M icroscopic observation and quantitative statistics of protoplast GFP fluorescence.A and D:GFP excitation of rice protoplasts transducted by pBI156spl,pBI156splm,pBI397lac and pBI397lacm.Bottom panels are enlarged sections of square shown in top panel.B and D:fluorescent ratio of rice protoplasts transducted by pBI156spl,pBI156splm,pBI397lac and pBI397lacm.C and F:relative intensity of fluorescence of rice protoplasts transducted by pBI156spl,pBI156splm, pBI397lac and pBI397lacm.Each column represents an average of ten replicates,and bars indicate SDs.

2.3 qRT-PCR检测RNA水平差异

为进一步验证通过GFP荧光观察方法的可靠性，我们通过qPCR方法对m iRNA和融合靶标序列的GFP表达水平进行检测。提取上述进行荧光观察的原生质体的总RNA，对RNA尾部加A后，用poly(T)adapter进行逆转录。逆转录产物用miRNA特异引物序列和poly(T)adapter特异反向引物进行qPCR反应，检测样品中miRNA的水平；用GFP基因特异引物gfpqrt和RP引物检测样品中GFP基因mRNA的水平。

检测结果表明，在水稻原生质体中osam iR156和osam iR397能够有效表达。以水稻actin基因作为内参，pBI156spl和pBI156splm质粒转化的原生质体中osam iR156的水平明显高于空载体pBI221-PML对照(图3A)；pBI397lac和pBI397lacm质粒转化的原生质体中osam iR397的水平也高于pBI221-PML对照(图3B)。

图3 qRT-PCR检测转化原生质体中m iRNA和GFP基因的表达水平Fig.3 Quantification of miRNA and GFP transcripts in rice protoplasts by qRT-PCR.(A)Relative expression level of osamiRNA156 in protoplasts transfected w ith pBI156spl,pBI156splm,and control plasmid.(B)Relative expression level of osamiRNA397 in protoplasts transfected w ith pBI156spl,pBI156splm,and control plasm id.(C)Relative expression level of GFP in protoplasts w ith pBI156spl or pBI156splm,respectively.(D)Relative expression level of GFP in protoplasts w ith pBI397lac or pBI397lacm,respectively.Each column represents three replicates,and bars indicate SDs.

以osam iR156表达水平为内参，pBI156spl转化原生质体中的GFP表达水平降至pBI156splm转化的原生质体的58%(P<0.05，图3C)；同样，以osam iR397的水平为内参，pBI397spl质粒转化的原生质体中的GFP表达水平降至pBI397lacm质粒转化的原生质体的71%(P<0.05，图3D)。结果表明，后缀可被剪切靶标序列的GFP基因转录物水平明显低于后缀不可被剪切的GFP基因转录物，说明m iRNA靶标序列确实受m iRNA调节影响其表达水平。

3 讨论

M icroRNAs是一类调节基因表达的小RNA，在动植物等真核生物及某些DNA病毒中均有发现[12]，在细胞生长发育及应对外界生物和非生物胁迫等反应中发挥重要作用[13-17]。据m iRBase数据库显示，水稻基因组中已预测有592种m iRNA，其中大部分还未知其靶标基因。由于m iRNA和靶标RNA的互补程度具有可变性，决定了m iRNA与靶标作用是冗余的[18-19]。另外，microRNA及靶标基因表达有时空特异性，使得直接克隆m iRNA和验证其靶标基因的工作变得十分繁琐而具有挑战性。通过计算机预测miRNA的靶标基因，对研究这些m iRNA的调控功能至关重要。目前，验证m iRNA和靶标基因相互关系的实验方法很多，其中通过5′RACE检测RNA中有无目标基因在靶向序列处的剪切产物是较常用的方法[20]。这种方法快速直接，但是实验结果仍需要其他方法的辅助验证。另外，也可以采取在m iRNA靶标基因缺失的植物体内，通过转基因过表达靶标基因和靶标序列突变的目的基因，比较二者的表达水平差异的方法[10]；或者通过构建转基因植株使m iRNA的表达水平不同，并检测靶标基因的表达差异的方法[11]。这种植物体内的遗传验证方法的优点是比较稳定，但是操作周期长。也有利用农杆菌注射瞬时表达的方法，在烟草体内检测m iRNA对靶标基因的调控作用[20]，但是在双子叶植物体系中并不适宜检测单子叶植物水稻的m iRNA及其靶标基因，因为双子叶和单子叶植物中与剪切靶标基因的蛋白并不完全相同，如AGO蛋白，在水稻中有19个，拟南芥中有10个，m iRNA与AGO的结合有一定偏好性[21]。

在真核生物中，小RNA对靶标基因的调控分为转录后的RNA干扰以及转录水平上的染色体修饰[22]。本方法是一种适宜检测m icroRNA转录后调控的简易方法，可以在水稻体内快速验证m iRNA和其靶标基因的调控关系。我们用水稻幼苗制备原生质体，载体转化效率约为40%，为后续基因检测提供便利。通过将miRNA及GFP/靶标序列融合基因串联表达载体转化水稻原生质体，既可以通过GFP荧光强度推断m iRNA对靶标序列的作用效果，又可以通过qPCR对含有靶标序列的融合基因mRNA水平进行定量，如果含有目标序列和突变目标序列的GFP融合基因的表达具有统计学差异，则判断m iRNA与靶标序列存在调控关系。此方法可以快速简便地在水稻体内验证m iRNA及其候选目标mRNA的关系，与转基因方法相比具有很大优势。另外，在其他单子叶植物中，如玉米，与水稻中编码DCL、AGO和RDR基因数目相近，进化树分析也显示这些基因的亲缘关系[23]，因此，也可以利用水稻原生质体研究与水稻亲缘关系较近的物种中新的m iRNA及其靶标的调控关系。

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(本文责编 陈宏宇)

Efficient transient expression to analyze m iRNA targets in rice protop lasts

Ping Guo1,2,Yao W u1,Jia Li1,3,Rongxiang Fang1,and Yantao Jia1

1 State Key Laboratory of Plant Genomics,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China 2 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China 3 Beijing City University,Beijing 100083,China

Compared w ith the transgenic approach,transient assays provide a convenient alternative to analyze gene expression.To analyze the relationship between m iRNAs and their target genes,a rice protoplast system to detect target gene activity was established.The M IRNA and GFP-fused target sequence(or GFP-fused mutated sequence as a non-target control)were constructed into the same plasm id,and then delivered into rice protoplasts.The GFP expression level decreased significantly when the protoplasts were transfected w ith the plasm id containing GFP-fused target compared to that of the plasm id w ith non-target sequence either by fluorescence m icroscopy or qRT-PCR method.Two m icroRNA genes,osaMIR156 and osaMIR397,and their target sequences were used to prove the feasibility of the rice protoplast transient assay system.This method w ill facilitate large-scale screening of rice m iRNA target in vivo,and may be suitable for functional analysis of m iRNAs of other monocot plants that m ight share the evolutionarily conserved small RNA processing system w ith rice.

m iRNA target,rice protoplast,in vivo fluorescence assay

February 17,2014;Accep ted:April 8,2014

Yantao Jia.Tel:+86-10-64861838;Fax:+86-10-64858245;E-mail:jiayt@im.ac.cn

郭萍,武瑶,李嘉,等.利用水稻原生质体快速分析m iRNA靶标RNA.生物工程学报,2014,30(11):1751−1762.

Guo P,Wu Y,Li J,et al.Efficient transient expression to analyze m iRNA targets in rice protoplasts.Chin J Biotech,2014, 30(11):1751−1762.

Suppo rted by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2011CB100703),National Natural Science Foundation of China(Nos.31370161,31030008).

国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2011CB100703)，国家自然科学基金(Nos.31370161,31030008)资助。

时间：2014-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140081.htm l