林红丽，侯申达，王嵩，王宇鹏，栾云艳，侯喜林

1黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319 2中山大学医学院，广东广州510000

表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的干酪乳杆菌免疫保护效力

林红丽1，侯申达2，王嵩1，王宇鹏1，栾云艳1，侯喜林1

1黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319 2中山大学医学院，广东广州510000

利用干酪乳杆菌作为传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2抗原传递系统，探讨口服雏鸡的免疫次数、免疫剂量、免疫途径和攻毒保护效果。用pLA-VP2重组干酪乳杆菌对5日龄雏鸡进行二次和三次免疫，并设108、109、1010CFU/m L的重组干酪乳杆菌组，间接ELISA检测血清IgG和小肠洗液sIgA，末免后7 d攻毒，计算保护效果。根据确定的2次免疫和109CFU/m L免疫剂量免疫5日龄雏鸡，分别口服、滴鼻/点眼pLA-VP2/ L.casei，口服、肌注商品活苗及口服pLA/L.casei和PBS为对照，监测IgG和sIgA抗体水平；末免后7 d检测脾淋巴细胞增殖情况并攻毒，7 d后剖检，观察法氏囊损伤程度并记录病变得分和保护率。结果表明各组的特异性sIgA、IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.01)；口服pLA-VP2/L.casei组的淋巴细胞刺激指数显著高于其他组(P<0.01)，保护率高达83.3%，免疫保护效果优于滴鼻/点眼组。因此，构建的重组干酪乳杆菌的安全性优于商品活苗，可以作为IBDV候选疫苗。

传染性法氏囊病毒(IBDV)，VP2蛋白，重组干酪乳杆菌，黏膜免疫，免疫次数，免疫剂量，免疫途径，保护率

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雏鸡高度接触性传染性疾病，是影响世界养禽业的重要疾病之一[1]。在易感的鸡体中，病毒主要侵害鸡的免疫器官，致使机体发生免疫抑制。鉴于市场上抗IBDV商品疫苗在免疫过程中易对法氏囊造成损伤，近十几年，国内外学者正致力于抗IBDV基因工程亚单位疫苗的研制。1996年，以色列的Pitcovski等[2]利用昆虫细胞表达VP2蛋白，并通过免疫攻毒试验检验对鸡的保护效果。重组VP2蛋白免疫组攻毒保护率达100%。1998年，澳大利亚的Sheppard等[3]利用禽腺病毒表达VP2蛋白，证明皮下注射方式可以诱导机体产生较高的抗体水平。1999年，日本的Tsukamoto等[4]利用重组的马立克氏病病毒(MDV)表达IBDV VP2蛋白，该重组疫苗对IBDV和MDV均可以提供较好的保护。2007年，浙江大学的Wu等[5]利用转基因稻米种子表达VP2蛋白，可以有效地保护机体抵抗IBDV的感染。

乳酸菌除了可以在胃肠道内定植，抑制病菌之外[6]，它还可以作为外源基因表达递送的载体。近十几年里，国内外研究人员已在乳酸杆菌中表达多种蛋白。2003年，美国的Dieye等[7]利用乳酸菌表达的IBDV VP2和VP3蛋白，具有较好的反应原性。2005年，Raha等[8]应用乳酸菌表达大肠杆菌自溶酶AcmA，获得约15 kDa的目的蛋白条带，且具有较好的反应原性，自溶酶AcmA蛋白成功展示在乳酸菌表面。2010年，温丽娟等[9]用乳酸菌表达大肠杆菌K 88、K99基因，成功构建了pLA-K88-K99重组干酪乳杆菌。通过口服和滴鼻/点眼途径免疫6−8周龄SPF级小鼠，诱导机体产生较高水平的特异性抗体。攻毒保护性试验检测其保护效率达到75%以上，而对照组死亡率达100%。本研究利用实验室构建的抗IBDV重组干酪乳杆菌分别经口服和滴鼻/点眼途径免疫雏鸡，并通过攻毒试验检测其免疫保护效力，为鸡传染性法氏囊病的基因工程黏膜疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、病毒、质粒和培养基

干酪乳杆菌pHCE1LB-pgsA(pLA)由本实验室保存；干酪乳杆菌阳性重组菌株pLA-VP2/ L.casei由本实验室构建保存；IBDV毒株由本实验室分离鉴定，命名为DQ株；IBDV B87株商品疫苗购自哈尔滨维科生物技术有限公司；所用培养基为MRS培养基，试验用鸡为商品蛋鸡。

1.1.2 主要试剂

R＆D IBDV IgG ELISA检测试剂盒、sIgA ELISA检测试剂盒购自北京奇松生物科技有限公司；HyClone 1640细胞培养液；美国Gibco公司胎牛血清，Solarbio谷氨酰胺；MERCK胰蛋白酶；天津灏样生物制品有限责任公司的鸡淋巴细胞分离液。

1.2 方法

1.2.1 重组干酪乳杆菌的表达

重组干酪乳杆菌的培养参照温丽娟等[9]发表的方法。取保存的重组菌按2%接种在6 m L含34 μg/m L氯霉素的MRS液体培养基中，厌氧条件下静止培养过夜。次日，取过夜培养活化的菌液按2%接种于100 m L含34 μg/m L氯霉素MRS培养基中进行培养。表达6 h后，5 000 r/min离心5 m in，收集菌体沉淀，用PBS洗涤3次，用显微镜进行菌体计数，将菌液稀释成5×109CFU/m L乳酸菌悬液，用于接种免疫。

1.2.2 IBDV超强毒半数感染量(ID50)测定

21日龄商品鸡随机分成7组，每组7只(0.1 m L/只)，每组攻毒剂量分别为100、10–1、10–2、10–3、10–4、10–5和10–6，攻毒后观察并记录鸡的死亡数量及法氏囊病变数量，应用Reed-Muench法[10]计算ID50。

1.2.3 免疫剂量及免疫次数试验

5日龄鸡随机分成A、B两组，每组40只，设A组免疫程序为两次免疫组(5日龄−9日龄一免，13−17日龄二免)，B组为3次免疫组(5日龄−9日龄一免，13−17日龄二免，21−25日龄三免)，每次免疫均连续免疫5 d。A1、A2、A3组和B1、B2、B3组，每组10只，分别口服免疫108、109、1010CFU/m L的重组干酪乳杆菌(0.1 m L/只)，对照组Ac、Bc每组10只(表1)，口服免疫同等剂量的PBS，每次免疫后采血，收集血清并收集胃肠道冲洗液，应用间接ELISA检测血清IgG和胃肠道洗液sIgA效价。

表1 免疫剂量和免疫次数试验分组Tab le 1 G rouping of imm unization dosages and tim es experim ent

A、B两组分别在末免后7 d攻毒DQ株，剂量为103ID50(0.1 m L/只)，并设攻毒PBS对照组Ac1、Bc1，和未攻毒PBS对照组Ac2、Bc2，每组5只。在攻毒后7 d安乐死，记录每只鸡体重和法氏囊重，计算法氏囊重/体重，比率用BBWR(Bursa-to-body weight ratio)表示。剖检法氏囊，记录法氏囊眼观病变。攻毒保护标准参照Huang等发表的方法[11]，并在此基础上加以改进，保护效果判定标准：1)临床上没有出现发病和死亡；2)法氏囊眼观病变得分[12]，记录得分为0的鸡的数量；3)计算BBWR，与阴性对照组平均值+2倍标准差相比，小于该值即判定为阴性，记录各组鸡阴性数量(表2)。

1.2.4 免疫途径试验

5日龄鸡随机分成A、B、C、D、E、F，共计6组，每组24只。A组为口服pLA-VP2/L.casei重组菌，B组为滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei，C组为口服pLA/L.casei，D组为口服IBDV活疫苗，E组为肌肉注射IBDV活疫苗，F组为口服PBS空白对照组，每只剂量为100 μL，A、B、C、F免疫程序及接种菌量按3.2.2最优选择(免疫次数为两次免疫，免疫剂量为109CFU/m L， 0.1 m L/只)，C、D组按商品化疫苗免疫程序。分别取免疫前、免疫后不同免疫时间的血清，检测特异性IgG抗体水平，取眼结膜、鼻腔、肺泡、胃、小肠冲洗液，检测特异性sIgA。每组取4只在末免后7 d取脾脏，用于淋巴细胞增殖试验。

表2 法氏囊眼观病变得分Tab le 2 Criteria forevaluation of gross lesion in the bursa

1.2.5 血清采集

各组分别于免疫前和免疫后5、10、15、20、25、30和35 d对鸡通过心脏采集抗凝血，将采好的血置于37℃温箱，1 h后取出，4℃过夜静置，次日3 000 r/m in离心15 m in，此时上清黄色液体即为血清，收集血清，–20℃保存备用。

1.2.6 小肠、支气管肺泡、眼结膜及鼻腔冲洗液采集

对鸡安乐死后打开腹腔和胸腔，暴露鸡小肠、支气管和肺脏，用注射器吸取PBS冲洗，反复3次，每次200 μL，收集洗液，用注射器取200 μL PBS反复冲洗眼结膜和鼻腔，收集眼部和鼻腔冲洗液，3 000 r/m in离心10 m in，收集上清，−20℃保存备用。

1.2.7 间接ELISA检测血清IgG和冲洗液sIgA

利用ELISA试剂盒检测血清IgG和小肠冲洗液、肺泡冲洗液、眼结膜鼻腔冲洗液sIgA抗体水平，检测过程严格按照ELISA检测试剂盒说明书进行，以试剂盒带有的阴性对照标准品为参照，OD450高于阴性对照的均判定为阳性。

1.2.8 脾脏T淋巴细胞的增殖试验

脾脏T淋巴细胞增殖试验参照Pradhan等[13]发表的方法。试验各组在末免后7 d每组取4只鸡，安乐死，取出脾脏；研磨脾脏，制成脾细胞悬液；将单细胞悬液用1640培养液稀释，细胞数为2×106个/m L，然后加入96孔板中，设4个重复，同时设阴性对照组。试验组用ConA刺激，阴性对照组应用培养液刺激，同时设不加脾细胞，只加培养液和只加ConA作为空白对照，然后置于5%CO2培养箱(37℃)中培养72 h。应用MTT比色法[14]检测脾细胞增殖情况。用分光光度计检测OD490吸光度。用刺激指数(Stimulation index,S.I.)反映增殖情况。

刺激指数(S.I.)=受到刺激的细胞OD490吸光度/阴性对照的细胞OD490吸光度。

1.2.9 攻毒试验

口服pLA-VP2/L.casei组、滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组、口服pLA/L.casei组、口服IBDV活疫苗组、肌肉注射IBDV活疫苗组中每组20只，在末免后7 d对每组进行攻毒，剂量为103ID50，每只100 μL；F组(PBS组)随机分成两组，分别为F1和F2组，F1组为攻毒PBS对照组，F2组为未攻毒PBS对照组。攻毒后观察每组鸡，检测保护效果。保护效果评价标准参照1.2.3，取法氏囊做病例组织切片。

1.2.10 病理切片的制作

采用常规切片制作方法，攻毒后7 d的鸡安乐死，取法氏囊，将法氏囊切成1 cm×1 cm的组织块，经固定、脱水、透明、包埋、切片、染色、脱蜡复水、苏木精染色、伊红染色、脱水、透明、封固后便可在显微镜下用40×视野下观察。

2 结果

2.1 半数感染量(ID50)的测定

应用Reed-Muench法测半数感染量(ID50)，测得传染性法氏囊病毒(IBDV)的ID50为 10–3.2/100 μL。

2.2 免疫次数及免疫剂量试验结果

2.2.1 间接ELISA检测血清IgG结果

通过间接ELISA检测每组血清中IgG水平，结果显示，二次免疫和三次免疫组IgG水平显著高于一次免疫组(P<0.01)，二次免疫和三次免疫差异不显著(P＞0.05)。在二次免疫组中，109CFU/m L和1010CFU/m L组抗体水平均显著高于108CFU/m L和PBS(P<0.01)，109CFU/m L和1010CFU/m L组抗体水平差异不显著(P＞0.05) (图1)。

2.2.2 间接ELISA检测小肠冲洗液sIgA结果

通过间接ELISA检测每组小肠冲洗液sIgA水平，结果显示，三次免疫组和二次免疫组sIgA水平显著高于一次免疫组(P<0.01)，二次免疫组和三次免疫组差异不显著(P＞0.05)；在二次免疫组和三次免疫组中，109CFU/m L和1010CFU/m L组抗体水平均显著高于108CFU/m L和对照组(P<0.01)，而109CFU/m L和1010CFU/m L组无显著差异(P＞0.05)(图2)。

图1 间接ELISA检测血清IgG抗体水平Fig.1 Serum IgG antibody titres in OD450detected by indirect ELISA.

图2 间接ELISA检测小肠洗液sIgA水平Fig.2 sIgA antibody titres in OD450detected by indirect ELISA.

2.2.3 攻毒保护试验结果

二次免疫组和三次免疫组攻毒对照组鸡均表现出20%的死亡率和100%发病率，未攻毒对照组均无死亡和发病情况；二次免疫组免疫剂量为108CFU/m L组无死亡情况，但发病率为40%，109CFU/m L、1010CFU/m L组无死亡，发病率为20%；三次免疫组108CFU/m L无死亡情况，发病率为30%，109CFU/m L、1010CFU/m L组无死亡率，发病率为20%。

法氏囊眼观病理变化试验A组为二次免疫组，B组为三次免疫组；A1、A2、A3为A组不同免疫剂量试验组(10 CFU/m L、109CFU/m L、1010CFU/m L)，AC1为阳性对照组，AC2为阴性对照组；B1、B2、B3为B组不同免疫剂量试验组，BC1为阳性对照组，BC2为阴性对照组(表3)。

攻毒后对鸡安乐死，记录各组鸡体重与法氏囊重，计算比率BBWR。BBWR=法氏囊重×1 000/体重。每组计算BBWR平均值，并应用统计软件进行统计学分析。记录法氏囊病变得分为0的鸡数量，计算干酪乳杆菌口服疫苗保护率。最终保护率计算以1.2.9中的3个标准分别计算保护率，最终取平均值。结果显示，二次免疫109CFU/m L和1010CFU/m L组保护率均为80%，108CFU/m L组保护率为60%；三次免疫109CFU/m L和1010CFU/m L组保护率为80%，108CFU/m L组保护率为70%(表4)。

表3 法氏囊眼观病理变化得分Tab le 3 Score of gross lesions in the bursa

表4 口服重组干酪乳杆菌保护率Tab le 4 Protectiveratio of orally vaccinating the recom bination L.casei

2.3 免疫途径试验结果

2.3.1 间接ELISA检测血清IgG结果

对免疫前和免疫后各组的鸡采血，在不同时间心脏采血，收集血清，进行间接ELISA检测，并绘制生长曲线，观察IgG抗体消长规律。结果显示，免疫前雏鸡在母源抗体存在条件下，抗体效价均较高，但在5日龄(一免)时开始呈现下降趋势(检测结果略)，PBS对照组显示抗体水平在免疫后10 d到达最低值，并趋于稳定；而口服pLA-VP2/L.casei和肌注商品活苗组血清IgG抗体效价显著高于其他组；滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei稍低于上述两组，但显著高于其他3组；然而，肌注商品活苗组在免疫后25 d时抗体效价呈现下降趋势，口服pLA-VP2/ L.casei组抗体效价呈现稳定趋势；各组在一免后抗体效价均呈现缓慢增长，二免后呈明显上升趋势，而对照组抗体效价变化不明显(图3)。

2.3.2 间接ELISA检测小肠、肺泡、眼结膜鼻腔冲洗液sIgA结果

间接ELISA检测结果显示，口服pLAVP2/L.casei和口服商品活苗组sIgA抗体效价显著高于其他组(P<0.01)；但口服商品活苗组在免疫后25 d时抗体效价开始呈现下降趋势，口服pLA-VP2/L.casei组可以维持较稳定的抗体水平；滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组低于上述两组(P<0.05)；对照组抗体效价变化不显著(P＞0.05)(图4)。

图3 间接ELISA检测不同免疫期血清IgG抗体效价Fig.3 Serum IgG antibody titres in OD450detected by indirect ELISA in the different immunity period.

图4 间接ELISA检测小肠冲洗液sIgA抗体效价Fig.4 sIgA antibody titres in OD450detected by indirect ELISA in small intestine washing fluid.

肺泡冲洗液检测结果显示，滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组抗体效价显著高于其他5组(P<0.01)，并且可以在免疫后20 d开始维持较稳定的抗体水平，但该组肺泡冲洗液中sIgA抗体效价(OD450<1.5)，显著低于口服pLA-VP2/ L.casei组小肠洗液sIgA抗体效价(OD450＞1.5)。肺泡洗液中sIgA抗体效价口服组显著低于滴鼻点眼pLA-VP2/L.casei组(P<0.01)，对照组抗体水平变化不显著(P＞0.05)(图5)。

眼结膜、鼻腔冲洗液检测结果显示，滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组抗体效价显著高于其他5组(P<0.01)，且在免疫后20 d达到最大值，并且开始趋于稳定，对照组抗体水平变化不大(图6)。

2.3.3 脾细胞增殖试验结果

脾细胞增殖试验结果显示，ConA刺激组刺激指数显著高于1640对照组(P<0.01)；两组中口服pLA-VP2/L.casei组的刺激指数均显著高于口服活苗组、肌注活苗组、口服pLA/L.casei组和PBS组(P<0.01)，显著高于滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组(P<0.05)(图7)。

图5间接ELISA检测肺泡冲洗液sIgA抗体效价Fig.5 sIgA antibody titres in OD450detected by indirect ELISA in pulmonary alveoli washing fluid.

2.3.4 剖检法氏囊病变和保护率结果

攻毒PBS对照组和pLA/L.casei对照组鸡均表现出10%的死亡率和100%发病率，未攻毒PBS对照组无死亡和发病情况；口服pLA-VP2/ L.casei组和滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组无死亡情况，发病率分别为15%和20%，口服商品活苗组无死亡率，发病率为40%；肌注商品活苗组无死亡率，发病率为35%。

图7 脾脏T淋巴细胞增殖试验Fig.7 Spleen T lymphocyte proliferation test.1: ConA stimulator group;2:1640 culture fluid stimulator group.

表5 法氏囊眼观病理变化得分Tab le 5 Score of gross lesions in the bursa

表6 pLA-VP2重组干酪乳杆菌保护率Tab le 6 Protective ratio of recom binant Lactobacillus casei

法氏囊眼观病变综合得分结果显示，口服pLA-VP2/L.casei组和滴鼻点眼pLA-VP2/L.casei组得分低于其他组，口服pLA-VP2/L.casei比滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei分数略低(表5)。

攻毒7 d后鸡安乐死，记录各组鸡体重与法氏囊重，计算比率BBWR。计算方法参照2.2.3。结果显示，口服pLA-VP2/L.casei组保护率达80%以上，滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组保护率为75%，其他组保护率均在50%以下(表6)。

2.3.5 法氏囊组织病理学检查结果

法氏囊病理切片结果显示，未攻毒PBS对照组髓质滤泡饱满，泡间组织正常；肌肉注射商品活苗组和口服pLA/L.casei髓质形成空泡，淋巴滤泡退化，如箭头所示；口服pLA-VP2/ L.casei组滤泡正常，无明显的病变；滴鼻点眼pLA-VP2/L.casei组淋巴滤泡正常，在法氏囊基膜下有少量红细胞，法氏囊轻微损伤；攻毒PBS对照组髓质形成空泡，淋巴细胞损伤，淋巴滤泡退化，法氏囊呈现严重病灶，如箭头所示(图8)。

图8 法氏囊病理学变化(显微镜40×视野)Fig.8 Histological pathologicalchanges in the bursa. (A)Unchallenge PBS control.(B)Commercial vaccine i.m..(C)pLA/L.casei oral.(D)pLA-VP2/L.casei oral. (E)pLA-VP2/L.casei intraocular-nasal.(F)Challenge PBS control.

3 讨论

目前现场常常使用中等毒力的弱毒活苗来预防IBDV感染，但是当有高水平母源抗体存在的情况下实施免疫常常会造成免疫失败，母源抗体低又会造成鸡法氏囊的损伤，如果免疫期不正确这种损伤会更加严重[13]。因此，许多学者致力于寻找新的免疫策略，在母源抗体存在的情况下仍然能够诱导局部和系统免疫的黏膜疫苗研究引起了广泛关注。本实验采用乳杆菌作为IBDV抗原的载体系统，初步探讨了免疫途径和免疫剂量对雏鸡的免疫效果。乳酸菌作为外源抗原递送载体经口服进入机体后在机体胃肠道定植，首先接触小肠黏膜，诱导小肠黏膜免疫产生sIgA[15]。乳酸菌表面携带有VP2外源蛋白，通过胃肠道在小肠定植后，小肠黏膜表面的免疫细胞快速识别特异性抗原，然后将抗原直接呈递到小肠黏膜，被肠黏膜的浆细胞识别后，产生sIgA，发生局部的黏膜免疫[16]。而乳酸菌处于对数生长期时，外源蛋白的表达量随菌体繁殖逐渐提高，但当菌体繁殖处于稳定期时，即使继续增加表达时间，蛋白表达量也不再提高，这可能就是二次免疫诱导的sIgA抗体水平与三次免疫差异不显著的原因。本研究中间接ELISA检测IgG，三次免疫和二次免疫免疫抗体水平差异不显著，这可能也是由于乳酸菌处于稳定期，蛋白表达量已经达到最大值，诱导机体体液免疫水平已处于最高峰，因此即使提高菌体数量，增加免疫次数也不会对免疫效果产生影响。

在攻毒保护试验中，从各组法氏囊眼观病变计算的平均得分结果可以看出二次免疫组和三次免疫组得分均低于攻毒PBS对照组，而二次免疫组得分与三次免疫组相同；109CFU/m L和1010CFU/m L法氏囊病变得分低于阳性对照组，109CFU/m L和1010CFU/m L法氏囊病变得分差别较小。这也证明了二次免疫，免疫剂量为109CFU/m L即可保护鸡抵抗IBDV感染，这一结果与间接ELISA检测结果相符。因此，确定的免疫次数为二次免疫，免疫菌体数量为109CFU/m L。

乳酸菌疫苗抵抗IBDV感染的免疫应答是通过Th2及其产物IgG1实现的。然而通过黏膜途径递送表达的VP2外源蛋白既可以诱导IgG1，也可以诱导IgG2，原因可能是Th1型细胞因子促进了其向IgG2a类别转换，而抑制了与Th2型免疫应答有关的IgG1的抗体水平[17]。由此推断乳酸菌疫苗促进了辅助型T细胞的免疫应答。具有Th1和Th2型细胞因子的特异性的IBDV VP2辅助型T细胞在胃内免疫途径中常常被发现，尤其是肠内和脾脏中[16]。因此通过口服方式免疫应该是较好的免疫途径，这与本研究中间接ELISA检测特异性抗体试验结果相符。

间接ELISA检测血清IgG结果显示口服重组菌组血清抗体水平和肌注商品活苗组抗体水平显著高于对照组(P<0.01)，且这两组抗体水平差异不显著(P＞0.05)。然而，间接ELISA检测血清中IgG抗体时，在免疫后25 d内，肌注商品活苗血清IgG抗体水平略高于口服重组菌组，但在25 d后肌注商品活苗组抗体水平开始呈现下降趋势，且于免疫后30 d开始低于口服重组菌组，而口服重组菌组在免疫后20 d抗体水平最高，而且呈现稳定趋势。2009年，齐炳理等[18]利用乳酸菌表达IBDV VP2蛋白免疫保护效果研究中证实，SPF鸡免疫后21 d试验组与对照组相比抗体水平有显著差异，免疫后36 d抗体水平达到最大值，这一结果的不同可能与本研究用商品蛋鸡有关。

在攻毒保护试验中，肌注活苗组的鸡法氏囊具有显著的眼观病理变化，组织病理切片中也有体现，口服重组菌组法氏囊没有明显的病变。由此可见，商品苗在免疫初期抗体水平较高，但抗体水平不稳定，而本研究构建的重组乳酸菌虽然诱导的抗体水平低于商品苗，但免疫后诱导机体抗体水平稳定，且安全性明显优于商品活疫苗；ELISA检测小肠、肺泡和眼结膜鼻腔冲洗液sIgA结果显示，口服重组菌组小肠中sIgA水平显著高于其他组(P<0.01)，滴鼻点眼组肺泡和眼结膜鼻腔冲洗液中sIgA水平显著高于其他组(P<0.01)，但sIgA抗体水平明显低于口服组小肠冲洗液(P<0.01)。综上，确定重组干酪乳杆菌免疫途径是口服免疫。分析本试验研究结果，发现虽然商品弱毒活疫苗的免疫诱导了高水平的特异性IgG抗体，但是免疫保护效果却很低，原因可能是保护效果的评价指标不同，评价角度不同，没有使用单一的攻毒死亡率来评价保护效果[19-20]，而是参考了Huang等[11]的评价标准。商品疫苗的保护率一般是以没有发病症状为标准来计算的，本试验除了这个指标外，还增加了法氏囊病理损伤和BBWR指标，因此试验中商品疫苗的保护率低。

本研究通过免疫后检测血清IgG和胃肠道、肺泡和眼结膜鼻腔冲洗液sIgA抗体水平及攻毒后的病理指标，确定了pLA-VP2重组干酪乳杆菌的免疫次数、免疫剂量及免疫途径。pLA-VP2重组干酪乳杆菌可能会成为未来预防鸡传染性法氏囊病的有效的疫苗产品，同时将会为禽类其他疾病口服基因工程黏膜疫苗研制提供可借鉴的参考。

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(本文责编 陈宏宇)

Immunogenicity of recombinant Lactobacillus casei expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus in chickens

Hongli Lin1,Shenda Hou2,Song Wang1,Yupeng Wang1,Yunyan Luan1,and Xilin Hou1
1 College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,Heilongjiang,China 2 Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510000,Guangdong,China

In order to determ ine immunogenicity and protective effect in chickens,we used the IBDV(Infectious bursal disease virus)-Vp2/Lactobacillus casei as antigen transfer system.First,the immunized and control chickens were challenged by IBDV/DQ at lethal dose to determ ine the protective ratio.Second,chickens were orallyand intranasally vaccinated tw ice w ith 109CFU/m L pLA-VP2/L.casei,pLA/L.casei and PBS as negativecontrol and commercial vaccine as positive control.The bursa injury and the lesion score wererecorded post challenge.The level of specific IgG and sIgA in pLA-VP2/L.casei and positive control groups was significantly higher than that in negativecontrol groups.The protection efficacy in pLA-VP2/L.casei oral group was higher than that inintranasal group.The SI.of pLA-VP2/L.casei oral group was significant higher than other groups.The lesion score indicated the pLA-VP2/L.casei was safer than commercial vaccine for bursa.Collectively,the pLA-VP2/L.casei could be a vaccine candidate for IBDV.

infectious bursal disease virus,VP2 protein,recombinant Lactobacillus casei,mucosalimmunity,immunization times,immunization dosage,immunization wags,protective ratio

January 10,2014;Accep ted:April 18,2014

Xilin Hou.Tel/Fax:+86-459-6819292;E-mail:xly_hou@163.com

林红丽,侯申达,王嵩,等.表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的干酪乳杆菌免疫保护效力的研究.生物工程学报, 2014,30(11):1679–1690.

Lin HL,Hou SD,Wang S,et al.Immunogenicity of recombinant Lactobacillus casei expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus in chickens.Chin J Biotech,2014,30(11):1679–1690.

Suppo rted by:Heilongjiang Postgraduates'Innovation Project(No.YJSCX 2013-11BYND).

黑龙江省研究生创新科研项目(No.YJSCX 2013-11BYND)资助。

时间：2014-10-10网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140021.htm l