李志红，Qiming Jane Wang

1 三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002

2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

蛋白激酶D1催化结构域在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化和活性测定

李志红1,2，Qiming Jane Wang2

1 三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002

2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

蛋白激酶D (Protein kinase D, PKD) 是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol, DAG) 受体，参与细胞内多种生理生化过程。为获得高纯度的PKD1的催化结构域 (PKD1-cat)用于晶体学结构的研究，将带有GST标签的PKD1-cat基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中，构建了重组质粒。将重组质粒转化到含穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞中，转座后获得了含目的基因GST-PKD1-cat的重组Bacmid。重组Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞后，获得重组杆状病毒并扩毒。将毒种以5 PFU/cell的感染复数感染悬浮培养的T.ni昆虫细胞，SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物。结果显示，表达产物在分子量约68 kDa处有一特异条带可与GST单克隆抗体发生反应。经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化和 PreScission Protease 切除GST标签后，得到了纯度很高的分子量约42 kDa的目的蛋白PKD1-cat。体外PKD激酶活性实验结果显示，随着PKD1-cat浓度的增加，激酶活性增高。这些结果显示截短的重组PKD1-cat有很高的催化活性和纯度，为采用核磁共振或晶体学方法解析PKD1-cat的三维结构奠定了基础。

蛋白激酶D，催化结构域，昆虫细胞，杆状病毒表达系统，表达，纯化

蛋白激酶D (Protein kinase D，PKD) 是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol, DAG) 受体，能传递G蛋白偶联受体或酪氨酸激酶受体的信号[1]。目前已鉴定的PKD家族成员有3个：PKD1、PKD2和PKD3。3种PKD亚型都包含N端的调节结构域和C端的催化结构域。N端调节域内有几个保守的模体：丙氨酸-脯氨酸富集的非极性区域、富含半胱氨酸的DAG结合结构域、酸性结构域和可能参与催化活性抑制调节的普列克底物蛋白同源域[2-3]。

PKD在细胞内具有多种功能，如参与细胞增殖与分化、细胞凋亡与细胞保护、高尔基复合体功能的调节、细胞迁移、侵润和粘附等[4-8]。由于PKD参与了细胞内诸多的生理生化过程，因此作为一个潜在的肿瘤治疗靶位，在最近几年受到了更多的关注[9-14]。然而遗憾的是，到目前为止，尚无任何一个关于PKD蛋白或其功能域的三维结构的研究成果，这极大地阻碍了我们对PKD所介导的信号转导通路的深入认识，也影响了以PKD及其配体为特异靶点的化学抑制药物的筛选研究[15-18]。

要想获得PKD的晶体结构信息，首先必须得到高纯度、高活性的蛋白。由于PKD蛋白分子量较大、其结构域复杂难于获得全长蛋白的结晶，本文首先在昆虫细胞/杆状病毒表达系统中表达并纯化得到了高纯度、高活性的PKD1的催化结构域 (PKD1-cat)，为后续PKD1-cat晶体学结构的研究奠定了基础。公司，羊抗鼠IgG-HRP购自Bio-Rad公司；ECL显色试剂盒购自Thermo公司；蛋白质定量检测试剂盒购自Bio-Rad公司；Sf-900Ⅱ SFM培养基购自Gibco公司；HyClone SFX-Insect培养基购自Thermo公司；胎牛血清购自Invitrogen公司；[γ-32P]ATP 购自Perkin Elmer Life Sciences公司；Histone Deacetylase 5 (HDAC5) 由Biobasic Canada Inc公司合成。

1.2 方法

1.2.1目的基因GST-PKD1-cat的PCR扩增

以本试验室构建并保存的pGEX6p-PKD1-cat质粒为模板，以GST-EcoRⅠ-F为正向引物，以PKD1-SpeⅠ-R为反向引物 (表1，由Invitrogen公司合成)，扩增GST-PKD1-cat目的基因。PCR反应条件：94 ℃变性5 min；以94 ℃变性15 s，68 ℃退火及延伸3 min为1个循环，共30个循环；最后68 ℃延伸10 min。反应结束后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2重组质粒pFastBac-GST-PKD1-cat的构建及鉴定

PCR产物经EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切后，克隆到同样酶切的pFastBac1载体中，转化E. coli XL-1 Blue感受态细胞，提取重组质粒进行EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切鉴定，筛选出的重组质粒由Invitrogen公司进行测序。测序无误后将重组质粒命名为pFastBac-GST-PKD1-cat，于−20 ℃冷冻保存。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株、质粒和细胞

大肠杆菌Escherichia coli菌株DH10Bac和质粒pFastBac1购自Invitrogen公司；草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9昆虫细胞购自美国ATCC；粉纹夜蛾Trichoplusia ni昆虫细胞购自Allele公司；pGEX6p-PKD1-cat重组质粒由本实验室构建。

1.1.2酶和主要试剂

pfx DNA聚合酶购自Invitrogen公司；T4 DNA连接酶、EcoRⅠ和SpeⅠ限制性内切酶购自BioLabs公司；蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitor)购自Roche公司；PreScission Protease购自GE公司；CellfectinⅡ试剂购自Invitrogen公司；n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (OG) 购自Anatrace公司；谷胱甘肽琼脂糖 (Glutathione Sepharose)购自GE公司；鼠GST单克隆抗体购自Santa Cruz

表1 文中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3重组Bacmid的构建及鉴定

按照Invitrogen公司Bac-to-Bac®Baculovirus Expression System说明书进行。简述如下：将重组质粒pFastBac-GST-PKD1-cat转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，蓝白斑法筛选重组菌落。挑取白色菌落提取Bacmid DNA，利用M13正向 (M13-F) 和反向(M13-R) 引物 (表1)，用PCR检测Bacmid DNA中是否含有目的基因。如果转座成功，PCR产物的大小应约为2 300 bp＋目的基因大小。

1.2.4 Sf9昆虫细胞的培养和重组杆状病毒的获得

Sf9昆虫细胞于Sf-900 Ⅱ SFM 培养基 (含10%胎牛血清) 中培养，培养温度27 ℃。重组Bacmid DNA在CellfectinⅡ试剂介导下转染生长状态良好的Sf9昆虫细胞，具体转染方法按Invitrogen 公司的CellfectinⅡ试剂说明书进行。待细胞出现明显病变后收集上清作为P1代重组病毒。将P1代病毒按1∶10稀释后，感染Sf9细胞，27 ℃培养48–72 h，待细胞出现明显病变后收集上清即得P2代病毒。用空斑试验 (见Bac-to-Bac®Baculovirus Expression System说明书) 进行病毒滴度测定。

1.2.5 Western blotting检测重组蛋白GST-PKD1-cat的表达

收集有明显病变的Sf9细胞液，1 200 r/min离心5 min，沉淀内加入细胞裂解液 (PBS，内含蛋白酶抑制剂 和 1% OG) 裂解30 min，12 000 r/min离心25 min。取上清加入SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸5 min后，进行SDS-PAGE。SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白电转印至硝酸纤维素膜。将转印好的硝酸纤维素膜用5%脱脂奶粉封闭，然后与鼠GST单克隆抗体结合。经TBST洗涤后与HRP标记羊抗鼠IgG作用，最后以ECL显色，观察特异性条带。

1.2.6 T.ni昆虫细胞的大量悬浮培养和病毒感染

在500 mL无菌锥形瓶中 (内装培养基200 mL) 进行T.ni细胞的大量悬浮培养，所用培养基为HyClone SFX-Insect (勿需添加胎牛血清)，培养条件为27 ℃，95 r/min。每天进行细胞计数，将细胞的生长密度控制在0.5×106–2×106个/mL。当细胞密度达到2×106个/mL后，将细胞铺板到15 cm的培养皿内，使细胞密度为70%–80%。待细胞贴壁后 (约10 min)，以感染复数 (MOI) 为5 pfu/cell的比例加入P2代病毒，于27 ℃培养箱内进行病毒感染。

1.2.7 PKD1-cat的纯化和SDS-PAGE检测

病毒感染72 h后，细胞出现明显病变。收集细胞液，1 200 r/min离心5 min。细胞沉淀内加入细胞裂解液裂解30 min，12 000 r/min离心25 min。取上清与Glutathione Sepharose Beads在4 ℃结合1 h，500×g离心5 min沉淀Beads。用PBS洗Beads去除杂蛋白后，在Beads中加入切割缓冲液 (20 mmol/L Tris，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，1% OG)和PreScission Protease，4 ℃切割过夜。10 000×g离心5 min，取上清，该上清中即含有纯化的目的蛋白。取少量上清进行蛋白质浓度测定和SDS-PAGE分析。蛋白质浓度测定采用Bio-Rad公司的蛋白质定量检测试剂盒，具体方法按试剂盒说明书进行。其余上清用超滤管浓缩后于4 ℃保存备用。

1.2.8纯化蛋白PKD1-cat的活性检测

以Histone Deacetylase 5 (HDAC5) 为底物，[γ-32P]ATP为磷的供体进行纯化蛋白的体外激酶活性实验[19]。反应混合物中含1.2 µmol/L HDAC-5，1 µCi [γ-32P]ATP，不同浓度的纯化蛋白PKD1-cat，50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，4 mmol/L MgCl2和10 mmol/L β-巯基乙醇。在30 ℃反应10 min后，取反应液25 μL置于Whatman P81滤纸上。为排除同位素直接黏附到滤纸或底物蛋白的可能性，将滤纸吹干后，用0.5%磷酸溶液洗3次，每次5 min，以洗去未掺入底物的γ-32P。将滤纸烘干，置于含10 mL蒸馏水的液闪瓶中，用Beckman LS6500液闪仪测定放射活性 (cpm)，并按以下公式计算激酶的活性 (pmol/min)。每个样品同时做3个平行管。

其中，校正后的放射活性=所测放射活性－空白管的放射活性，反应时间为10 min，反应体积为50 µL，点样体积为25 µL。

2 结果与分析

2.1 目的基因PCR产物和重组质粒的鉴定

以pGEX6p-PKD1-cat质粒为模板，采用PCR技术扩增GST-PKD1-cat基因。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在1 500−2 000 bp之间出现特异性条带，长度与预期值 (约1 800 bp) 相符 (图1A)。PCR产物经EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切后，克隆到同样酶切的pFastBac1载体上，构建重组质粒。提取重组质粒进行EcoRⅠ和SpeⅠ酶切鉴定，电泳后检测到2条谱带：1条为pFastBac1载体，另1条约1 800 bp，与目的条带GST-PKD1-cat的预期结果相符 (图1B)。测序结果显示该重组质粒中确实含有目的基因片段，且读码框正确，表明重组质粒pFastBac-GST-PKD1-cat 构建成功。

图1 GST-PKD1-cat的PCR产物鉴定 (A) 和重组质粒的酶切鉴定 (B)Fig. 1 Identification of PCR product of GST-PKD1-cat (A) and recombinant plasmid by enzyme digestion (B). (A) M: DNA marker; 1: PCR product. (B) M: DNA marker; 1: recombinant plasmid digestion by EcoRⅠand SpeⅠ.

2.2 重组Bacmid的鉴定

重组质粒pFastBac-GST-PKD1-cat转化含穿梭载体Bacmid的DH10Bac细胞，挑取白色菌落提取Bacmid DNA。用M13引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳显示在约4 100 bp处出现了特异性条带 (图2)，与预期结果 (约2 300 bp＋目的片段大小1 800 bp) 一致，表明转座成功，目的基因已转座到Bacmid上，得到了重组Bacmid。

2.3 Western blotting检测重组蛋白GST-PKD1-cat的表达

重组Bacmid DNA转染生长状态良好的Sf9昆虫细胞，待细胞出现明显病变后收集细胞。裂解细胞，用鼠GST单克隆抗体作为一抗，对细胞裂解液进行Western blotting分析。结果显示，表达产物在蛋白相对分子质量约68 kDa处有一特异条带 (图3)，与预计的GST-PKD1-cat融合蛋白的相对分子质量相同 (GST的相对分子质量约26 kDa，PKD1-cat约42 kDa)，表明GST-PKD1-cat融合蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达。

2.4 GST-PKD1-cat的大量表达及PKD1-cat的纯化

图2 重组Bacmid的PCR鉴定Fig. 2 Identification of PCR product of recombinant bacmid. M: DNA marker; 1: PCR product of recombinant bacmid using primer M13.

大量悬浮培养T. ni昆虫细胞，感染重组杆状病毒，收集有明显病变的细胞裂解、离心。上清液与Glutathione Sepharose Beads结合，用PBS洗去杂蛋白后，加入PreScission Protease切除GST标签。离心后取上清，经SDS-PAGE电泳检测，在蛋白相对分子质量约42 kDa处出现单一条带 (图4)，与预期的PKD1-cat的相对分子质量相同，表明PKD1-cat得到成功纯化。采用Bio-Rad 公司的蛋白质定量检测试剂盒进行蛋白质浓度测定，通过对不同批次纯化的PKD1-cat蛋白的浓度测定，1 000 mL培养基培养的细胞均可纯化得到高纯度的PKD1-cat蛋白约1 mg。

图3 表达产物的Western blotting分析Fig. 3 Western blotting analysis of expression product. M: protein marker; 1: lysate of Sf9 cells infected with recombinant bacmid.

图4 SDS-PAGE分析纯化结果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified protein. M: protein marker; 1: lysate of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus; 2: purified PKD1-cat.

2.5 纯化蛋白PKD1-cat的活性检测

以HDAC-5为底物，[γ-32P]ATP为磷的供体进行纯化蛋白的体外激酶活性实验。反应混合物中含1.2 µmol/L HDAC-5，1 µCi [γ-32P]ATP和不同浓度的PKD1-cat。30 ℃反应10 min后，用液闪仪测定放射活性 (cpm) 并计算不同浓度下激酶的活性 (pmol/min)。结果显示 (表2)，随着PKD1-cat浓度的增加，激酶活性增高，说明纯化的PKD1-cat有很好的催化活性。

表2 PKD1-cat的体外激酶活性实验结果Table 2 Result of in vitro kinase assay using purified PKD1-cat

3 讨论

PKD最早于1994年由Valverde等[20]发现，曾一度被认为是PKC家族中的一类非典型成员(Protein kinase Cμ，PKCμ)[21]，但在随后的研究中发现PKD的激酶结构域 (Kinase domain) 与钙/钙调素依赖性蛋白激酶 (Calcium/ calmodulin-dependent protein kinase, CAMK) 家族的同源性要高于PKC家族，故现已归类为CAMK家族激酶[22]。

PKD在细胞内发挥信号转导作用，需要其DAG结合结构域与DAG结合，以及其催化结构域与底物结合，因此这两个结构域对其功能的实现极其重要[2,23]。考虑到PKD蛋白分子量较大 (110 kDa)、且结构域复杂难于得到全长蛋白的结晶，我们选择了首先在体外表达PKD1的催化结构域 (PKD1-cat)。

昆虫细胞/杆状病毒表达系统是近年来应用较多的真核表达系统。在该系统中表达的外源蛋白产量高，能够进行翻译后修饰、加工，且表达的外源蛋白大多是可溶性的，其生物学活性、结构与功能等与天然蛋白极其相似，因此选择该系统作为本研究的蛋白表达系统[24]。

为提高该蛋白在昆虫细胞中的表达产量，我们对表达条件进行了优化。首先，对于重组杆状病毒的扩增，我们选择在贴壁生长的Sf9昆虫细胞中进行。用于感染细胞的病毒不易传代过多，一般使用P2、P3代毒种进行细胞的病毒感染。其次，对于蛋白的大量表达，我们选择在T.ni昆虫细胞中进行。可用500 mL、

1 000 mL或更大体积的锥形瓶进行T.ni细胞的大量悬浮培养，锥形瓶内所装培养基的体积不超过锥形瓶容积的2/5。在27 ℃、95 r/min的培养条件下，T.ni细胞生长很快，一般21 h可扩增一代。每天进行细胞监测，控制细胞密度在0.5×106−2×106个/mL。当细胞密度达到2×106个/mL后，将悬浮培养的T.ni细胞铺板到15 cm的培养皿内，待细胞贴壁后再进行病毒感染，因为在贴壁生长的细胞中，病毒感染效率更高。

在蛋白纯化方面，为便于纯化蛋白，我们先表达了带GST标签的GST-PKD1-cat融合蛋白，再通过Glutathione Sepharose亲和层析纯化和PreScission Protease切除GST标签，获得了PKD1-cat目的蛋白。经SDS-PAGE电泳检测，该蛋白纯度高，无其他杂蛋白，体外激酶活性实验也显示该蛋白具有很好的催化活性，可用于蛋白结晶条件的筛选。因此本研究为PKD1-cat晶体学结构的研究奠定了基础。

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(本文责编 陈宏宇)

Expression, purification and characterization of catalytic domain of protein kinase D1 in baculovirus-insect cell expression system

Zhihong Li1,2, and Qiming Jane Wang2

1 College of Medical Science, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China
2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

Protein kinase D (PKD) is a novel family of serine/threonine kinases and diacylglycerol (DAG) receptors and has been documented in a variety of cellular processes. To get high purity catalytic domain of PKD1 (PKD1-cat) for crystallography study, the GST-tagged PKD1-cat gene was cloned into a baculovirus transfer vector pFastBac1 (donor plasmid). When the recombinant plasmid was transformed into DH10Bac competent Escherichia coli, which contains a baculovirus shuttle vector (bacmid), transposition occurs to generate a recombinant bacmid containing the gene of interest (GST-PKD1-cat). The recombinant bacmid DNA was transfected into Spodoptera frugiperda Sf9 insect cells to generate recombinant baculovirus, which was then amplified through multiple rounds of infection in Sf9 cells. After that, Trichoplusia ni insect cells in suspension culture were infected with baculoviral stock at a multiplicity of infection (MOI) of 5 PFU/cell. SDS-PAGE and Western blotting analysis confirmed the detection of a 68 kDa protein by the glutathione S-transferase (GST) monoclonal antibody. The recombination protein was purified by Glutathione sepharose affinity chromatography and cleaved by PreScission Protease to remove GST tag, and a highly pure 42 kDa protein which was consistent with the molecular weight of the expected PKD1-cat protein was detected on SDS-PAGE. The activity of purified PKD1-cat protein was determined by in vitro PKD kinase assay. Our data showed that the kinase activity increased with the concentration of purified PKD1-cat protein. These results showed that the truncated recombinant PKD1-cat protein was highly active and pure, and could potentially be used for solving 3D structure of this protein by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) or crystallography.

protein kinase D, catalytic domain, insect cell, baculovirus expression system, protein expression, purification

October 9, 2013; Accepted: December 16, 2013

Zhihong Li. Tel/Fax: +86-717-6396818; E-mail: lizhihong923@163.com

李志红, Qiming Jane Wang. 蛋白激酶D1催化结构域在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化和活性测定. 生物工程学报, 2014, 30(8): 1291−1298.

Li ZH, Wang QJ. Expression, purification and characterization of catalytic domain of protein kinase D1 in baculovirus-insectcell expression system. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1291−1298.

Supported by: Scientific Research Foundation for the Talents of China Three Gorges University (No. KJ2008B054).

QJ Wang. Tel: +1-412-383-7754; Fax: +1-412-648-1945; E-mail: qjw1@pitt.edu

三峡大学人才科研启动基金 (No. KJ2008B054) 资助。

时间：2014-02-17 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130517.html