李长健，张旻，洪炀，韩艳辉，曹晓丹，韩宏晓，傅志强，朱传刚，陆珂，李浩，林矫矫

1上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234 2中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫重点实验室，上海200241

动物及兽医生物技术

日本血吸虫SjRAD23基因的克隆表达及基因重组抗原的免疫保护效果

李长健1,2，张旻2，洪炀2，韩艳辉2，曹晓丹2，韩宏晓2，傅志强2，朱传刚2，陆珂2，李浩2，林矫矫2

1上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234 2中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫重点实验室，上海200241

辐射敏感蛋白23具有核苷酸切除修复功能，在泛素蛋白酶体途径中起到重要作用。本研究利用PCR技术克隆了日本血吸虫辐射敏感蛋白23(SjRAD23)编码的cDNA序列，成功获得SjRAD23的基因序列，其ORF为1 053 bp。构建SjRAD23基因重组表达质粒pET28a(+)-SjRAD23，并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达，重组蛋白在上清和沉淀中都有存在。利用免疫组化技术检测该蛋白在虫体的分布情况，该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，免疫小鼠血清中检测到较高水平的特异性IgG、IgG1和IgG2a。Western blotting分析显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别。用重组蛋白rSjRAD23免疫结果与206佐剂对照组比较，rSjRAD23在BALB/c小鼠中诱导了35.94%减虫率，40.59%肝脏减卵率。结果表明SjRAD23具有作为疫苗候选分子的潜力。

日本血吸虫，辐射敏感蛋白23，表达，免疫保护，疫苗候选分子

血吸虫病(Schistosom iasis)是由血吸虫感染引起的一种慢性寄生虫病，危害严重，是我国重要的公共卫生问题之一。被世界卫生组织认定为具有社会经济破坏的寄生虫病，流行于全球70多个国家和地区，约6亿人生活在有感染危险的环境中，深受其害[1-2]。寄生于人体的血吸虫主要有3种：日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫，流行于我国的是日本血吸虫。虽然半个多世纪以来，我国血吸虫病防治取得巨大成就，但该病防治形势依然严峻。在血吸虫病治疗方面，目前唯一大规模使用的治疗药物是吡喹酮，有研究表明在长期使用吡喹酮的情况下，可以产生对中国大陆株血吸虫的抗药性[3-4]。所以，如果有有效的疫苗再结合药物治疗，可能会给防治血吸虫病带来更为理想的防治效果[5-6]。

泛素是一类低分子量的蛋白质，泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程[7]。泛素化是真核细胞中广泛存在的蛋白修饰方式，在蛋白质的定位、代谢、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞增殖、凋亡、分化、转录调节、基因表达、损伤修复、信号传递、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控[8-9]。RAD23是蛋白泛素化过程中的配体蛋白，具有泛素连接酶E3的功能，其C末端具有泛素相关基序(Ubiquitin-associated motif，UBA)，能够与多泛素蛋白链相结合，同时也在N端具有一泛素样结构域(Ubiquitin-like domain，UBL)，能够指引配体蛋白和底物蛋白进入蛋白酶体，蛋白酶体可以识别多泛素化修饰的底物蛋白，进而促使泛素化修饰的底物蛋白进入蛋白酶体进而被降解[10]。此外，Rad23蛋白还可能保护多泛素蛋白侧链免遭泛素蛋白水解酶的降解作用。同时，泛素化相关蛋白能够借助RAD23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。由于RAD23在泛素化过程中起到重要作用，所以RAD23参与重要的生命活动的调控[11]。尽管RAD23在其他物种已有相关报道，但关于日本血吸虫RAD23蛋白尚未报道。

我们实验室在日本血吸虫蛋白质组学中鉴定到辐射敏感蛋白(SjRAD23)。本研究根据NCBI数据库中的日本血吸虫辐射敏感蛋白(SjRAD23)基因序列(GI:226470141)克隆表达了SjRAD23基因，通过Western blotting、ELISA及动物保护实验评估了SjRAD23重组蛋白在小鼠中诱导的免疫保护效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与寄生虫

日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺实验室提供；雄性(SPF)6−8周龄BALB/c小鼠购自上海史莱克动物实验中心；新西兰大白兔(雄性2.0−3.5 kg)购自上海罗泾飞达动物实验中心。

1.1.2 主要试剂和菌种

206佐剂为SEPPIC公司的QP239129；限制性内切酶XhoⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA连接酶、Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、pMT19-T载体等购自TaKaRa生物工程有限公司；DNA marker DL2 000、DL5 000，小量质粒抽提试剂盒和DAB底物显色液，感受态大肠杆菌DH5α、BL21 (DE3)，购于上海天根生物科技有限公司；QIAquick®Gel Extraction Kit购自Qiagen公司；Agarose、DEPC、DNA latter、Bradford Reagent蛋白定量试剂盒等购自上海生工生物工程公司；硝酸纤维素膜(Whatman)购自北京经科宏达生物技术有限公司；Bacto-yeast extract、Bacto-trypton为Oxoid公司产品；Ni-NTA His Bind Resin(Merck-Novagen)购自中科新生命生物科技有限公司；四甲基联苯胺(TMB)购自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP购自北京康为世纪生物工程公司。表达载体pET28a(+)和日本血吸虫成虫由中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 虫体的收集及c-DNA制备

新西兰大白兔以腹部贴片法分别感染2 000−20 000条尾蚴，并分别于感染42 d后剖杀，肝门静脉灌注法收集虫体，将虫体置于液氮冻存备用。将液氮保存的虫体取出，按照Trizol试剂盒说明书进行总RNA提取及纯化。反转录按照TaKaRa试剂盒说明书来操作进行。

1.2.2 SjRAD23基因的克隆及生物信息学分析

根据日本血吸虫辐射敏感蛋白SjRAD23 (GI:226470141)基因的ORF序列，设计引物，以日本血吸虫42 d成虫cDNA为模板，用PCR方法扩增含有完整ORF的cDNA序列片段。上游引物P1：GCG GGATCC ATGAAGGTTACTTTC，下游引物P2：CAG CTCGAG TCATACCATTTCATC。斜体下划线部分分别为上下游引物的酶切位点部位。PCR反应条件为：92℃预变性10 m in，92℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 m in。PCR产物纯化回收以后，将其亚克隆至pMD19-T载体，并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，培养12−16 h后挑取单菌落进行扩大培养8 h后提取质粒，将质粒命名为pMD19-T-SjRAD23。质粒双酶切鉴定后，将阳性质粒送上海华津生物科技有限公司测序。将测序得到的cDNA序列在NCBI上进行同源性比对。用DNAStar软件分析该基因的ORF，并对该基因的等电点、残基数、蛋白相对分子量进行分析。利用软件Signal(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)对其序列信号肽进行预测，利用CBS服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services)提供的TMHMM Server v.2.0预测氨基酸序列的跨膜结构域。

1.2.3 重组质粒pET28α(+)-SjRAD23的构建与表达

将测序鉴定正确的SjRAD23的ORF序列的5ʹ端和3ʹ端分别加入Bam HⅠ和XhoⅠ两个酶切位点后定向亚克隆至原核表达载体pET28a的多克隆位点上，构建得到pET28a(+)-SjRAD23重组质粒，并转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中。挑取单菌落进行扩大培养，通过菌液PCR鉴定和双酶切鉴定正确后，阳性质粒送上海华津生物科技有限公司测序。将鉴定测序正确的阳性菌液接种至LB培养基，37℃，250 r/m in，振荡培养，当OD值=0.6时加入终浓度为1 mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导表达。在诱导剂加入后不同时间段收取菌液，以SDS-PAGE电泳分析最佳表达时间及鉴定表达蛋白的存在形式。用不同浓度的Tris-HCl缓冲液进行多次透析，最终获得稳定的pET28α(+)-SjRAD23重组蛋白。

1.2.4 重组蛋白rSjRAD23多克隆抗体的制备及动物免疫保护实验

将30只6−8周龄雄性BALB/c小鼠随机分成3组，每组10只。分别为PBS对照组，206佐剂对照组和重组蛋白rSjRAD23免疫组。PBS对照组每次每只皮下注射100µL的PBS。206佐剂对照组每次每只皮下注射100µL的206佐剂与PBS的乳化液，其中乳化剂中含有乳液54µL。重组蛋白rSjRAD23免疫组每次每只皮下注射100µL的重组蛋白rSjRAD23与206佐剂的乳化液，其中乳化剂中含有206佐剂54µL，含重组蛋白rSjRAD23(20µg)46µL。以相同的免疫计量，每隔两周免疫1次，共免疫3次。分别于第1次免疫前1周及每次免疫后1周经眼眶静脉采集小鼠血液，37℃静置1 h，4℃、2 000 r/min离心10 m in，分离并收集血清于−20℃保存。第3次免疫2周后，每只小鼠经腹部皮肤贴片攻击感染40±2条日本血吸虫尾蚴。在感染尾蚴42 d剖杀小鼠，收集血清，以肝门静脉灌注法收集虫体并计数，计算减虫率。同时，收集肝脏，称重，置于50 m L离心管内，加入适量去离子水，用匀浆机匀浆后定容至20 m L。取1 m L匀浆液和10%NaOH等体积混合，56℃水浴消化20 m in，消化完全后取20µL在光学显微镜下计算虫卵数，每份样品重复计数3次，取其平均值，按照以下公式计算减虫率和减卵率(EPG=每克肝组织中的虫卵数)。

减虫率=[1−免疫组平均虫荷数/206佐剂对照组平均虫荷数]×100%

肝脏减卵率=[1−免疫组EPG/206佐剂对照组EPG]×100%

1.2.5 间接ELISA法检测特异性抗体

纯化的重组蛋白rSjRAD23用紫外分光光度计测定其浓度，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将纯化的重组蛋白rSjRAD23稀释至10µg/m L，包被96孔酶标板，每孔100µL。将收集的各组小鼠血清1∶100稀释后作为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗小鼠IgG1-HRP和羊抗小鼠IgG2a-HRP作1∶5 000稀释后作为二抗，可溶性单组分TMB 100 m L避光显色，2 mol/m L硫酸终止反应，最后置于酶标仪测定450 nm处的吸光度，检测抗体水平。

1.2.6 间接免疫荧光技术分析SjRAD23的虫体组织定位

取日本血吸虫42 d新鲜成虫虫体，制成厚度为10µm的冰冻切片，−20℃用丙酮固定30 m in后用10%山羊血清封闭2 h。以重组蛋白rSjRAD23免疫的BALB/c小鼠血清作为一抗孵育1 h，以正常小鼠血清作为阴性对照，Cy3标记的山羊抗小鼠的IgG作为二抗孵育1 h，加入10µg/m L DAPI溶液室温避光复染5 m in，置荧光显微镜下观察蛋白的分布情况。

1.2.7 Western blotting分析重组蛋白rSjRAD23的抗原性

将纯化的重组蛋白rSjRAD23进行SDS-PAGE电泳，低温转移至硝酸纤维素(NC)膜上，以日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清(实验室保存提供)作为一抗，正常的小鼠血清作为阴性对照，以羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5 000)作为二抗，二氨基苯胺(DAB)作为底物进行显色观察。

1.3 统计学分析

利用Graph Pad Prism 5对实验数据进行t检验分析。

2 结果

2.1 SjRAD23基因的克隆及生物信息学分析

以42 d成虫cDNA作为模板，应用PCR技术克隆获得含有完整ORF的SjRAD23编码基因。分析表明该基因ORF为1 053 bp，编码351个氨基酸，预测分子量大概为37.88 kDa，等电点为4.46。获取的目的基因通过BLSAT比对，结果显示该基因与NCBI GenBank中日本血吸虫辐射敏感蛋白(RAD23，GI:226470141)基因序列的相似性为100%。经生物信息学分析该蛋白不含跨膜结构域，不含信号肽。

2.2 SjRAD23基因的原核表达及重组蛋白的纯化及鉴定

经过PCR、双酶切鉴定及测序，证实pET28α(+)-SjRAD23重组表达质粒构建成功(图1)。pET28a(+)-SjRAD23重组表达质粒在大肠杆菌BL21中诱导表达，SDS-PAGE结果显示重组蛋白以可溶性和包涵体形式存在。重组蛋白分子量约为44 kDa，与预测的分子量相符(图2)。

2.3 间接ELISA法检测特异性抗体结果

利用间接ELISA法检测免疫小鼠血清中抗rSjRAD23特异性抗体IgG抗体水平变化。实验结果显示，重组蛋白免疫组小鼠在第1次免疫后就能够检测到抗rSjRAD23特异性IgG抗体，第2次免疫后特异性IgG抗体水平升高，第3次免疫后又进一步升高，剖杀时特异性IgG抗体水平基本保持不变。而206佐剂组对照组和PBS空白对照组在3次免疫及剖杀后特异性IgG抗体基本保持不变。t检验分析表明，重组蛋白免疫组与206佐剂组对照组和PBS空白对照组比较，特异性IgG抗体水平差异极显著(P<0.01) (图3)。

在一免、二免及三免后重组蛋白rSjRAD23在小鼠体内诱导产生了特异性的IgG1和IgG2a抗体，且呈现上升趋势，而206佐剂对照组却没有诱导产生特异性的IgG1和IgG2a抗体。免疫组与对照组比较，差异极显著(P<0.01)(表1)。

2.4 间接免疫荧光分析SjRAD23的虫体组织定位结果

在荧光显微镜下可以观察到Cy3标记的羊抗小鼠二抗IgG发出红色荧光，DAPI复染细胞核后发出蓝色荧光(图4A)。用免疫前小鼠血清作为阴性对照(图4B)。实验结果表明该蛋白广泛分布在虫体表膜中及部分虫体实质中(图4)。

图1 SjRAD23基因的克隆及重组质粒双酶切鉴定；Fig.1 Cloning of SjRAD23 gene and the identification of recombinant plasmid pET28a(+)-SjRAD23 by Eco RⅠand XhoⅠdigestion.(A)PCR Product of SjRAD23 gene.M: DNA marker DL2 000;1:PCR product of SjRAD23 gene. (B)Identification of the recombinant plasmid pET28a(+)-SjRAD23 by Bam HⅠand XhoⅠ.M:DNA marker DL5 000;2:production of the recombinant plasmid pET28a(+)-SjRAD23 by Bam HⅠand XhoⅠdigestion.

图2 SDS-PAGE分析pET28a(+)-SjRAD23/BL21重组蛋白的表达Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression products of pET28a(+)-SjRAD23/BL21 in E.coli.M:protein marker; 1,2:expression of plasm id pET28a and recombinant plasm id of pET28a(+)-SjRAD23;3:purified recombinant protein of pET28a(+)-SjRAD23/BL21.

2.5 Western blotting分析重组蛋白rSjRAD23的抗原性

以纯化的重组蛋白rSjRAD23作为抗原，以日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清作为一抗进行Western blotting分析，结果显示在44 kDa呈现一条明显的条带，而正常小鼠血清作为阴性对照在此处未有条带出现(图5)，表明重组蛋白rSjRAD23具有良好的抗原性。

2.6 动物保护性实验结果

重组蛋白pET28α(+)-SjRAD23免疫保护实验显示与206佐剂对照组比较显示，rSjRAD23在BALB/c小鼠中诱导表达了35.94%减虫率，40.59%肝脏减卵率。t检验分析表明差异显著(P＜0.05)(表2)，说明rSjRAD23在BALB/c小鼠中诱导产生了部分的免疫保护效果。

表1 rSjRAD23诱导产生的抗体亚型分析Tab le 1 Analysis of the level of IgG subtype induced by vaccination w ith rSjRAD23

图4 SjRAD23蛋白在42 d日本血吸虫虫体内的免疫组织定位(100×)Fig.4 The localization analysis of SjRAD23 by

immunofluorescence in 42 d worms(100×).

图5 重组蛋白SjRAD23的Western b lotting分析Fig.5 Western blotting analysis of recombinant SjRAD23 protein.M:protein marker;1:probed w ith m ice serum specific to schistosome adult worm antigen preparation; 2:probed by negative mouse serum.

3 讨论

日本血吸虫生活史复杂，中间宿主是钉螺，终末宿主包括人类及其他多种哺乳动物，危害严重。截止2012年底，我国推算日本血吸虫病人共计240 597例[12]。日本血吸虫体被是与宿主直接接触的界面，是血吸虫摄取营养物质和运送代谢物质的重要场所。同时，日本血吸虫体被表膜含有一些重要的生长因子、通道蛋白、受体、信号转导蛋白，在日本血吸虫生长发育过程中起到重要作用[13-14]。例如，乙酰胆碱通过与表膜上的乙酰胆碱受体作用，可以辅助血吸虫吸收营养和神经调节[15]。更值得关注是，在日本血吸虫不同的生长发育阶段，为了适应宿主内不同的环境，其体被表膜不断地更新和改变，以修复宿主抗体损伤的部位，从而逃避宿主的免疫攻击。因此，体被相关蛋白的研究对于日本血吸虫病疫苗发展和免疫诊断具有重要意义[16]。

RAD23最初是从酵母辐射突变体(Radiation sensitive mutant，RAD)中分离发现的[17]。早期研究发现该蛋白能够促使核酸切除修复(Nucleotide excision repair，NER)复合体中的TFIIH与RAD14的结合，在DNA的切除修复过程中起到重要作用[18-19]。RAD23是蛋白泛素化过程中的配体蛋白，蛋白泛素化是真核细胞内广泛存在的蛋白修饰方式，泛素化在蛋白的定位、代谢、功能及降解中都起到重要作用，同时它也参与了细胞增殖、分化、基因表达、损伤修复等生命活动的调控[20]。越来越多的研究表明，蛋白质的泛素化在调节细胞免疫应答中发挥着非常重要的作用[21-22]。RAD23具有泛素连接酶E3的功能，其C末端具有泛素相关基序(Ubiquitin-associated motif，UBA)，能够与多泛素蛋白链相结合，同时也在N端具有一泛素样结构域(Ubiquitin-like domain，UBL)，能够通过泛素-26S蛋白酶体途径在细胞周期调控、基因表达、细胞增殖分化等生物过程中发挥重要作用[23-24]。

表2 BALB/c小鼠免疫保护效果Tab le 2 Resu lts of protective efficacy against S.japonicum challenge in BALB/c m ice induced by rSjRAD23

本实验首次克隆、表达了日本血吸虫辐射敏感蛋白SjRAD23，生物信息学分析表明该蛋白不含信号肽和跨膜结构域。间接免疫荧光实验分析显示日本血吸虫SjRAD23蛋白广泛分布于虫体表膜和部分实质中。间接ELISA和Western blotting结果都显示重组抗原rSjRAD23可被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清识别，表明日本血吸虫SjRAD23具有较好的抗原性和免疫原性。用纯化的rSjRAD23蛋白免疫小鼠后，实验结果显示小鼠产生了较高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体，IgG1参与激活Th2型辅助细胞，IgG2a与激活Th1型辅助细胞有关[25]，表明rSjRAD23诱发小鼠产生了抗日本血吸虫感染的Th1/Th2混合型免疫反应。PBS组和206佐剂组中在3次免疫后未能产生针对重组蛋白rSjRAD23的抗体，只在感染6周后出现很低滴度的抗rSjRAD23的特异性抗体。推测其原因可能是：首先，RAD23是蛋白泛素化过程中的配体蛋白，主要参与26S蛋白酶体调控，而调控过程主要是在真核细胞内进行，因此此蛋白主要存在于细胞内，难以诱导较高滴度的特异性抗体；其次，血吸虫蛋白种类非常多，RAD23可能含量较低，只是虫体源的蛋白难以诱导较高滴度的特异性抗体。重组蛋白免疫组小鼠感染后6周的抗体与第3次免疫后抗体比较没有差异，可能是因为第3次免疫后针对重组蛋白的特异性抗体没有能够继续上升；也可能是由于小鼠感染血吸虫后，如上所述，重组蛋白只产生很低滴度的特异性抗体。动物保护实验显示，重组蛋白rSjRAD23免疫的BALB/c小鼠与206佐剂对照组比较，减虫率和减卵率分别为35.94%和40.59%，获得部分免疫保护效果。这些都表明，日本血吸虫SjRAD23具有成为日本血吸虫疫苗的候选抗原的潜能。SjRAD23蛋白作为蛋白泛素化途径中的重要配体蛋白，在泛素化过程中起到重要的作用，可能也在日本血吸虫的生长和发育过程中产生了重要、不可替代的作用，2005年Guerra-Sa R等也实验证明了泛素蛋白酶体途径对曼氏血吸虫的生长发育的重要性[26]。有关日本血吸虫SjRAD23蛋白在日本血吸虫体内具体的作用机制仍需进一步深入研究。

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(本文责编 郝丽芳)

Cloning,expression and protective efficacy evaluation of radiation sensitive protein 23(RAD23)from Schistosoma japonicum

Changjian Li1,2,M in Zhang2,Yang Hong2,Yanhui Han2,Xiaodan Cao2,Hongxiao Han2, Zhiqiang Fu2,Chuangang Zhu2,Ke Lu2,Hao Li2,and Jiaojiao Lin2
1 College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China 2 Key Laboratory of Animal Parasitology,M inistry of Agriculture,Shanghai Veterinary Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 200241,China

Radiation sensitive protein 23(RAD23)is a nucleotide excision repair(NER)protein that plays an important role in Ubiquitin-proteasome pathway(UPP).Schistosoma japonicum radiation sensitive protein23(SjRAD23)cDNA sequences were amplified by PCR and cloned into pET28a(+)vector to construct recombinant expression plasm id pET28a (+)-SjRAD23.The recombinant protein was expressed as both inclusion bodies and the supernatant in Escherichia coli BL21(DE3)cell.Immunofluorescence observation show s that SjRAD23 was mainly distributed on the tegument surface of the worms.ELISA assay reveals that specific IgG,IgG1 and IgG2a antibodies could be detected in the sera of rSjRAD23 immunized mice.Western blotting analysis shows that the recombinant SjRAD23 could be recognized by serum specific to soluble adult worm antigen of S.japonicum.BALB/c m ice vaccinated w ith rSjRAD23 combined w ith 206 adjuvant revealed 35.94%worm reduction and 40.59%liver egg reduction when compared w ith that of the adjuvant control group.This study suggests that rSjRAD23 has the potential as a vaccine against schistosome infection.

Schistosoma japonicum,SjRAD23,expression,immunoprotection,vaccine candidate

February 19,2014;Accep ted:April 25,2014

Jiaojiao Lin.Tel:+86-21-34293440;E-mail:jjlin@shvri.ac.cn

李长健,张旻,洪炀,等.日本血吸虫SjRAD23基因的克隆表达及基因重组抗原的免疫保护效果.生物工程学报,2014, 30(11):1669−1678.

Li CJ,Zhang M,Hong Y,et al.Cloning,expression and protective efficacy evaluation of radiation sensitive protein 23 (RAD23)from Schistosoma japonicum.Chin J Biotech,2014,30(11):1669−1678.

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