黄钦耿

(1. 福建省麦丹生物集团有限公司福州研究中心，福建 福州 350008；2. 福建师范大学工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350107)

L-亮氨酸为哺乳动物8种必需氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、医药等行业，市场需求量逐年增多[1]。迄今为止，L-亮氨酸工程菌株主要有大肠杆菌和棒状杆菌。其中以谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌为出发菌株的研究最多[2]。谷氨酸棒杆菌是一类重要的工业氨基酸生产菌株，已成为一个工业生物技术及转化的平台菌株，每年生产数百万吨的氨基酸[3]，其中包括作为风味增强剂的L-谷氨酸(350万吨/年)和作为饲料和食品添加剂的L-赖氨酸(250万吨/年)等[3]。谷氨酸棒杆菌在氨基酸的发酵方面，除了L-谷氨酸和L-赖氨酸这类大宗氨基酸之外，还包括许多的小品种氨基酸，如三类支链氨基酸(branched-chain amino acid，BCAAs)：L-缬氨酸、L-异亮氨酸及L-亮氨酸[4-6]，其每年需求量约在1000～3000吨，其中L-亮氨酸的需求量约在500～800吨/年，特别在饲料行业中，L-亮氨酸作为动物营养有着特殊的作用，因此受到研究者的广泛关注。随着其应用的不断拓展，市场也在持续攀升[2]。

目前，发酵法生产L-亮氨酸的，日本企业占主导地位，尤以日本味之素公司，其在亮氨酸产量和品质均具有明显优势，大罐产酸能力达30～35 g/L，糖酸转化率为22%～28%，可达70%以上的提取率，合计年产量400～500吨。迄今为止，工业化L-亮氨酸生产菌主要通过传统诱变筛选获得的，这种经典育种方法虽可获得L-亮氨酸相对高产的优良菌株，但该法也会引入有害突变，使目标菌株生长缓慢，杂酸增多。另外，这种方式工作量大，周期长，很难在短期内进一步提高目标物产量。为了克服这些问题，理性化代谢工程育种正成为氨基酸高产菌株获得的主要方式。

代谢工程是在对代谢网络系统分析的基础上，从合成生物学的视角出发，采用基因工程技术修饰代谢途径，定向改造细胞合成系统、转运系统和细胞调控系统，以提高产物得率或改进细胞性能的目的[2]。本研究以先期通过传统复合诱变手段、结合结构类似物的筛选方法获得的一株具有L-甲硫氨酸及L-赖氨酸原养型，高浓度α-噻唑丙氨酸及α-氨基亮氨酸结构类似物抗性的产L-亮氨酸菌株——谷氨酸棒杆菌MD106(CorynebacteriumglutamicumMD106)为出发菌株，利用谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032基因组序列为模板，采用自杀载体pk18mobsacB介导的基因重组手段，失活panBC基因以及alaT基因，减少L-亮氨酸合成前体物丙酮酸和α-酮基异戊酸消耗，增强L-亮氨酸代谢流，实现对L-亮氨酸合成途径的优化，为进一步代谢工程优化改造L-亮氨酸菌株获得高产L-亮氨酸的工程菌奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 谷氨酸棒杆菌MD106(CorynebacteriumglutamicumMD106)为本室选育并保存；载体克隆受体菌EscherichiacoliJM109购自TAKARA；自杀载体pk18mobsacB质粒为中国科学院微生物研究所李寅研究员赠送。

1.1.2 主要工具酶和试剂 限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等均购自TAKARA；基因组提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒等均购自上海生工。其他药品均为国产分析纯。

1.1.3 引物 根据Genbank的谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032基因组序列，分别设计panBC基因以及alaT基因的融合重叠延伸PCR引物。其中，划线部分序列重叠延伸互补序列，方框中的序列分别为EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点。

panBC基因的融合延伸引物设计如下：

panBC-2：5′- AACTACAGACCTAGAACCTAAGCATCAACAATGCGTCGAATC-3′

panBC-3：5′- TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTGCTTATCGACGCCCTCCTCC-3′

alaT基因的融合延伸引物设计如下：

alaT-2：5′-AACTACAGACCTAGAACCTATTGAGGAGTGCTTGGGTGGTCATG-3′

alaT-3：5′-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTACTGGACCAAAGCAATACGCACGTGG-3′

1.1.4 培养基 LB培养基：配方参阅参考文献[7]；LB+10%蔗糖培养基：LB培养基的基础上添加10%的蔗糖；LBG培养基：LB培养基添加0.5%的葡萄糖；菌株的种子及发酵培养基：企业内部资料(略)。

1.2 方法

1.2.1panBC基因及alaT基因上下游片段的扩增 采用细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌MD106，并以此为模板，采用panBC-1、panBC-2引物对与alaT-1、alaT-2引物对扩增panBC和alaT基因的上游片段，panBC-3、panBC-4引物对与alaT-3、alaT-4引物对扩增panBC基因的下游片段。

反应体系为50 μL：ddH2O 33 μL，10×Ex buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物1、2(或3、4)各2 μL，MD106基因组1 μL，ExTaq酶2 μL，混合后进行PCR扩增。

PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃最后延伸10 min。反应结束后，胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.2 ΔpanBC基因与ΔalaT基因的融合扩增及亚克隆 采用上述获得的回收目的片段，分别以panBC和alaT的上下游片段通过融合PCR扩增获得截短的panBC基因(ΔpanBC)及截短的alaT基因(ΔalaT)。

PCR扩增的反应体系为50 μL：ddH2O 30 μL，10×Ex buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物1、4各2 μL，回收的上游片段及下游片段各2 μL，ExTaq酶2 μL，混合后进行PCR扩增。

PCR反应程序：95℃预变性10 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃最后延伸10 min。反应结束后，胶回收试剂盒回收目的片段。

回收获得的目的片段进行T-A连接，并转化感受态JM109细胞，菌落PCR筛选获得阳性克隆，并送交上海生工进行测序。

1.2.3 自杀敲除组件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT的构建 将ΔpanBC与ΔalaT的阳性克隆质粒与敲除载体pk18mobsacB同时用限制性内切酶EcoRI、SalI进行双酶切。

双酶切体系60 μL：ddH2O 33μL，ΔpanBC、ΔalaT、pk18mobsacB质粒15 μL(约1 μg)，10×H buffer 6 μL，EcoRI、SalI 各3 μL，37℃水浴过夜酶切。

双酶切产物切胶回收后用于后续连接反应，连接反应体系20 μL：ddH2O 3 μL，双切回收ΔpanBC、ΔalaT片段12 μL，pk18mobsacB 2 μL，10×ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 1 μL，16℃过夜连接。

连接反应结束后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃，120 r/min复苏1 h，取300 μL涂布于含卡那霉素终浓度50 μg/mL的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养约20 h。挑单菌落接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250 r/min培养过夜，提质粒筛选阳性克隆并进行酶切鉴定。

1.2.4 谷氨酸棒杆菌MD106的panBC基因的失活 将获得的pk18ΔpanBC重组载体电击转入谷氨酸棒杆菌MD106感受态细胞[采用艾本德(Eppendorf)电转仪，电击条件为：1800 V，电击时间约为4～5 ms]。重组质粒电击转入宿主之后，首先进行第一次重组，即通过单交换的方式整体插入线性插入染色体中，此步可通过含25 μg/mL卡那霉素的LBG平板进行筛选，平板上生长的克隆可视为成功进行一次重组的克隆，对获得的已经进行一次重组的单克隆进行LB液体摇菌过夜，并划线含10%蔗糖的LB平板，再分别点植LBG及LBG+卡那霉素(25 μg/mL)平板，进行二次重组筛选，并对能够再LBG平板生长，不能在LBG+卡那霉素(25 μg/mL)平板生长的克隆进行PCR验证，并进行测序验证染色体panBC基因是否被ΔpanBC替换。

1.2.5 谷氨酸棒杆菌MD106(ΔpanBC)的alaT基因的失活 在获得的panBC失活菌株的基础上，进一步进行染色体alaT基因的失活，将pk18ΔalaT重组载体电转导入谷氨酸棒杆菌MD106(ΔpanBC)，方法同pk18ΔpanBC的电转及筛选操作。筛选阳性克隆进行PCR验证，并进行测序验证染色体alaT基因是否被ΔalaT替换。获得谷氨酸棒杆菌MD106(ΔpanBC-ΔalaT)。

1.2.6 摇瓶发酵培养 将谷氨酸棒杆菌MD106(ΔpanBC/ΔalaT)与对照菌株谷氨酸棒杆菌MD106，进行摇瓶的二级发酵：一级种子30℃，200 r/min培养18 h，15%移种量转接发酵摇瓶，30℃，200 r/min发酵40 h，测定菌体密度及分析L-亮氨酸及杂酸类型和含量。

2 结果与分析

2.1 ΔpanBC基因及ΔalaT基因的融合扩增及验证

以谷氨酸棒杆菌MD106基因组为模板，分别进行panBC基因及alaT基因上下游序列的扩增(图1-A)，获得基因片段大小与理论预测的基本一致。

以获得的上下游片段互为模板，通过重叠延伸PCR的方法获得中间缺失了427 bp基因序列的panBC基因(ΔpanBC基因)和中间缺失412 bp基因序列的alaT基因(ΔalaT基因)，其大小与理论预测基本一致(图1-B)。测序结果显示：融合的ΔpanBC基因和ΔalaT基因与ATCC13032的相关序列几乎完全一致，证明融合片段构建成功。

A：M为200bp leader marker，1、2为panBC基因的上下游片段，3、4为alaT基因的上下游片段B：M为DL2000 DNA leader marker，5为ΔpanBC基因融合片段，6为ΔalaT基因融合片段

图1 ΔpanBC基因及ΔalaT基因的融合扩增

2.2 自杀敲除组件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT的构建

EcoRⅠ与SalⅠ双切的ΔpanBC与ΔalaT片段与同样的酶切并回收的载体pk18mobsacB线性片段连接产物转化感受态JM109，并提取质粒进行酶切验证(图2)。结果显示，自杀敲除组件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT的构建成功。

M：λ-EcoT14 DNA leader marker；1：阴性对照(pk18mobsacB双切)；2：pk18ΔpanBC载体的双切；3：pk18ΔalaT载体的双切

图2 pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT重组载体的酶切验证

2.3 重组载体转化MD106及变株的筛选、验证

自杀敲除组件pk18ΔpanBC及pk18ΔalaT转化出发菌株谷氨酸棒杆菌MD106后，因载体含有KmR基因，在含25 μg/mL的卡那霉素培养基进行初次筛选，获得一次重组的菌株，一次重组的克隆不多，效率不高，总共不到10个克隆，这与pk18mobsacB载体本身特性有关。一次重组菌中的染色体中还含有sacB基因，利用蔗糖进行反筛选，以蔗糖为基质进行再次筛选，过滤掉一次抗性平板筛选过程中存在的游离载体，选择性进行保留二次重组的菌株。根据pk18mobsacB重组特性，在进行二次重组的过程中，可能出现回复变株，其概率在50%左右，所以需要对二次重组的克隆需要进行进一步的PCR验证，以菌落为模板，分别以panBC-1、panBC-4引物对和alaT-1、alaT-4引物对为引物，进行PCR筛选和验证，结果见图3。结果显示，阳性克隆的PCR产物较对照(以原始MD106基因组为模板)明显要小，而且对截短的PCR产物进行测序分析，确认基因panBC及alaT基因分别被ΔpanBC和ΔalaT基因替换。

M：200 bp DNA leader marker，1：ΔpanBC基因替换验证，2：阴性对照(MD106菌落PCR验证)，3：MD106(ΔpanBC)菌株PCR验证，4：panBC缺失基础上的ΔalaT基因替换验证

图3panBC及alaT基因缺失菌株的菌落PCR验证

2.4 panBC、alaT基因失活对MD106发酵产L-亮氨酸的影响

以初步优化的培养基，采用摇瓶二级发酵的方式，对panBC、alaT基因失活菌株及原始MD106菌株进行发酵实验，考察双基因缺失对菌株生长、L-亮氨酸产率以及杂酸合成的影响。结果(表1)显示：(1)panBC、alaT双基因失活的重组菌株的生物量较对照菌株差别不大，说明在现有培养基的情形下，双基因的缺失基本不会对菌体生长造成较为明显的影响。(2)panBC、alaT双基因的失活有利于增强L-亮氨酸的代谢流，提高L-亮氨酸产酸率。(3)alaT基因的失活，大大减少了MD106菌株的丙氨酸合成能力，其丙氨酸的合成量减少超过80%。(4)panBC、alaT双基因失活菌株，其发酵总杂酸明显较对照菌株要低，而且幅度不仅仅只局限于丙氨酸的减少上，说明双基因的缺失对于L-亮氨酸的生物合成带来影响的同时，也对其他氨基酸的合成带来了调控，而且这种调控对于积累L-亮氨酸合成来说是有益的。

表1 panBC、alaT双基因缺失菌株与对照菌株的部分发酵指数

3 讨论

丙酮酸是合成三支链氨基酸的共同前体物，α-酮基异戊酸既是L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸的间接前体物。因此，在进行L-亮氨酸代谢工程改造时，应在增加丙酮酸合成代谢流的同时，使丙酮酸的代谢流尽可能的流向α-酮基异戊酸，另外，在分支途径中还应使α-酮基异戊酸主要流向L-亮氨酸。

丙酮酸的支路代谢主要包含：通过转氨合成丙氨酸，这一路经很容易实现，而且对丙酮酸的消耗巨大，催化合成这一过程主要包括两个转氨酶，即AvtA(avtA基因编码)和AlaT(alaT基因编码)，其中AlaT对丙氨酸的合成贡献更大，有研究[8]表明，失活AlaT之后，细胞的丙氨酸的合成大大降低，而且由于AvtA的氨基供体为L-缬氨酸，所以，通过失活alaT基因，不仅大量减少丙氨酸合成，减少丙酮酸的消耗，且还相对能促进L-缬氨酸的消耗，并提供L-亮氨酸合成的间接前体物α-酮基异戊酸的量，这一点在本研究当中也得到验证，失活alaT基因之后丙氨酸的量降低超过80%，且杂酸比例也大大降低。

D-泛酸的合成以α-酮基异戊酸为直接前体，经羟基酮泛酸甲基转移酶(panB基因编码)和泛酸合成酶(panC基因编码)等催化，最终合成泛酸。通过失活泛酸合成的相关酶系，增加L-亮氨酸合成前体物，增强L-亮氨酸代谢流[9]。

本研究在传统方法选育获得一定遗传标记的产L-亮氨酸菌株MD106的基础上，采用代谢工程手段L-亮氨酸的前体物丙酮酸及α-酮基异戊酸的消耗路径进行了修饰，使得L-亮氨酸的产率明显提高，而且杂酸比例大大减少，为下一步的菌种构建提供了保障，证明代谢工程的技术路线完全适应于L-亮氨酸的菌种改造，为进一步构建高产L-亮氨酸工程菌打下了基础。

参考文献：

[1] LEE J W, NA D, PARK J M, et al. Systems metabolic engineering of microorganisms for natural and non-natural chemicals[J]. Nat. Chem. Biol, 2012(8): 536-546.

[2] HAN M W, J B PARK. Recent progress in development of synthetic biology platforms andmetabolic engineering of Corynebacterium glutamicum[J]. Journal of Biotechnology, 2014(180):43-51.

[3] BECKER J, WITTMANN C. Bio-based production of chemicals, materials and fuels-Corynebacterium glutamicum as versatile cell factory[J]. Curr. Opin. Biotechnol, 2012(23):631-640.

[6] SATOSHI H, MASAKO S, KIMIO U, et al. Engineering ofCorynebacteriumglutamicumfor High Yield L-Valine Production under Oxygen Deprivation Conditions[J]. Appl. Environ. Microbiol, 2013, 79(4):1250-1257.

[7] 萨姆布鲁克J，拉塞尔D W．分子克隆实验指南：第三版[M]．北京：科学出版社，2002.

[8] JAN M, LOTHAR E. Metabolic Function of Corynebacterium glutamicum Aminotransferases AlaT and AvtA and Impact on L-Valine Production[J]. Appl. Environ. Microbiol, 2008, 74(24): 7457-7462.

[9] HERMANN S, LOTHAR E. d-Pantothenate Synthesis inCorynebacteriumglutamicumand Use ofpanBCand Genes Encoding L-Valine Synthesis for d-Pantothenate Overproduction[J]. Appl. Environ. Microbiol, 1999, 65(5):1973-1979.