段金海，徐书雯，莫建伟，肖豪，莫思杰，胡涛

临床研究

Alzheimereimer患者血清中含有低水平及低亲和力的抗A Aβ 自身抗体

段金海1，徐书雯1，莫建伟1，肖豪1，莫思杰2，胡涛2

1广东省人民医院神经内科//广东省医学科学院//广东省老年医学研究所//广东省神经科学研所，广东广州510080；2广东省南海福利中心，广东佛山528226

目的研究AD病人血清中Aβ自身抗体的特性及对老年斑的亲和力。方法选择AD、血管性痴呆（vascular dementia,VD）患者及正常老年人做为研究对象，采集血清标本，测定抗体含量，并亲和纯化抗体进行免疫组化染色。结果AD患者血清中含有低水平的Aβ自身抗体，但抗体含量与性别、年龄和MMSE评分没有相关性；AD体内的抗体不能识别Tg2576鼠脑内的老年斑。结论Aβ自身抗体的降低是AD病人特有的免疫低反应性所致；Aβ自身抗体与老年斑的亲和力明显降低；这些抗体的病理生理作用需要进一步研究。

阿尔茨海默病；血管性痴呆；抗Aβ自身抗体

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是以进行性加重的记忆认知功能减退为主要临床特点的中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为老年斑（senile plaques,SPs）及神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）。β-淀粉样蛋白（amyloid β-peptide,Aβ）具有神经毒性，其在脑内的生成增多及异常聚集是AD发病的关键因素。研究认为Aβ在体内可以诱导出抗Aβ自身抗体，因为从静脉用免疫球蛋白可以分离出抗Aβ自身抗体［1］，并且可从人类B细胞克隆出Aβ抗体［2］。流行病学调查也发现，与正常人相比AD患者的血清和脑脊液含有低滴度的Aβ自身抗体［3］。但是这些自身抗体的病理生理作用仍然不清楚。在AD转基因鼠和Ⅰ期临床试验中，Aβ1-42疫苗可以诱导出特异性的Aβ抗体，并显示出良好的免疫原性和安全性［4］，但在Ⅱa期临床试验（AN1792）中，6％的受试者出现了无菌性脑膜脑炎［5］。目前认为，脑炎的发生与Aβ1-42全肽及佐剂QS21'导致的Th1'细胞免疫反应有关［6］。因此，在把免疫疗法做为AD的预防和治疗措施之前，有必要对AD患者体内的Aβ自身抗体进行细致的研究。本课题试图分析AD患者抗Aβ自身抗体的特性并在体外观察抗体与老年斑的接合能力。

1 材料和方法

1.1 受试对象

从2004年4月~2013年9月，选取广东省南海福利中心、广东省人民医院、广州市老人院以及中山大学附属第一医院的住院的AD、血管性痴呆（vasculardementia,VD）患者及正常老年人（healthy controls, HC）做为研究对象。AD入组标准:（1）符合美国国立神经病学传染病及中风研究所与阿尔茨海默病和相关病协会（NINCDS-ADRDA）的诊断标准；（2）Loeb改良缺血量表评分均小于4分；（3）排除其他原因所致痴呆；（4）患者视、听力及精神状态允许合作完成神经心理学测试。VD入组标准：（1）患有脑梗死或脑出血病并经脑CT或MRI确诊；（2）痴呆，符合美国精神病学会的《精神障碍诊断及统计手册》第四版修订版(DSM-Ⅳ-R) VD的诊断标准；（3）卒中3个月后发生痴呆，病程超过3个月，且认知功能呈突然或阶梯性下降（4）Hachiski评分≥7分；（5）排除失语及卒中前有认知功能障碍者。正常对照组系普外科及骨科非神经系统疾病者，没有记忆认知功能下降病史及澘在影响记忆认知功能的疾病。研究对象的临床特征见表1。

1.2 方法

1.2.1 血清标本的收集和处理清晨空腹采血，装入无菌试管，不加抗凝剂，室温静置30 min后，1000 g，4℃，离心10 min。上清分装入另外一支无菌管，－70℃保存。

1.2.2 ELISA采用间接ELISA法检测，Aβ42浓度（10 μg/孔）包被96孔聚苯乙烯反应板（Greiner公司），每孔100µl，4℃孵育过夜。3％小牛血清37℃封闭2 h。加入倍比稀释的血清样品（从1∶10开始稀释）。过氧化物酶标记山羊抗人IgG（武汉博士德公司），1∶2 000稀释，每孔100 ml，37℃孵育40 min，洗涤。TMB显色，2M H2SO450 ml中止，于波长450 nm下测定每孔A值，以样本孔吸收值比空白孔吸收值之比大于2.1为阳性。单克隆抗体8G7（Calbiochem,USA）作为阳性对照，建立标准曲线。

1.2.3 抗体纯化33％和50％饱和硫酸铵盐析：按常规方法进行［7］。溴化氰(CNBr)活化的Sephrose 4B柱层析：按试剂说明书操作，即取1.5 g CNBr-activated Sephrose 4B冻干粉，溶胀、重悬后，与4 mg的Aβ42蛋白混合,封闭、洗涤后装柱。以50 ml PBS（pH 7.4）平衡柱（流速，60 ml/h），加入盐析的粗提的IgG，用洗脱液（50 mmol/L HCl-甘氨酸缓冲液，pH分别为2.5和1.5交替进行）洗脱，出峰时收集流出的组分，用碳酸盐缓冲液调节pH至中性，透析48 h，于4℃保存。纯化效果采用15％SDS-PAGE进行分析。

1.2.4 Western blot参照李少兵等［8］的方法，标准品为GST-Aβ42融合蛋白，Mr约为30 000。加样时，每孔10 μl(含Aβ42 20 μg)，恒压120 V电泳。卸胶、清洗及装架后，恒流50 mA电转90 min。取出PVDF膜经双蒸水洗涤、3％BSA封闭和TBST洗涤后，依次加入1∶100纯化的样品和1∶2 000的HRP-羊抗人IgG，室温孵育2 h，上述两步后分别用TBST洗涤5次，时间分别为1、2、 3、4、5 min。DAB显色。以小鼠抗人Aβ42mAb（8G7）作为阳性对照。

1.2.5 免疫组织化学Tg2576鼠脑石蜡切片常规脱蜡入水，抗原修复。染色按SABC法并严格按照试剂盒说明进行。纯化抗体的稀释度为1∶100。以小鼠抗人单克隆Aβ1-42抗体作阳性对照。

1.2.6 统计分析全部数据采用SPSS 11.0分析。

2 结果

用ELISA方法，结果发现正常人、VD和AD病人血清中都出现抗Aβ自身抗体，但相比正常人和VD，AD患者的抗体含量明显减少，而VD和HC组则没有显著性差异（表1）。AD的抗体含量与性别、年龄及MMSE评分都没有相关关系。在VD和HC组，也没有发现这种相关性。Western blot分析显示，AD、VD及HC的纯化Aβ自身抗体及小鼠抗人Aβ42mAb在Mr为30 000处有蛋白结合带，与GST-Aβ42融合蛋白质的结合位置相符合（图1）。免疫组化染色结果显示，三组研究对象的纯化抗体均不能与Tg2576鼠脑内的Aβ斑块结合。

表1 研究对象临床特征简表(Mean±SD)

图1 Western blot检测血清Aβ自身抗体

3 讨论

与以往结果［8-9］相似，本实验发现AD患者及正常人血清中含有抗Aβ自身抗体，而与正常人相比，AD患者的抗体含量显著降低。虽然VD与AD有不同的病理机制，但是在其血清中也发现了抗Aβ自身抗体，且与正常人相比无差异，而比AD患者则显著升高。用Westernblot方法发现，纯化的抗体均可检测到GST-Aβ42融合蛋白。但是AD患者的抗体含量与性别、年龄及MMSE评分没有相关性。虽然随着年龄的增加，老年人的免疫反应呈下降的趋势，但是AD患者Aβ自身抗体含量的降低与老年人总体免疫反应水平下降无相关性［10］。因此这些结果提示，Aβ自身抗体的降低是AD病人特有的免疫低反应性所致。Monsonego等［11］也观察到了相似的结果，用Aβ肽接种APP转基因鼠和野生鼠，发现在转基因鼠诱导出的Aβ抗体水平明显低于野生鼠。转基因鼠及AD病人的T淋巴细胞体外培养也发现，Aβ肽诱导的T淋巴细胞增殖反应较非转基因鼠明显降低［12-13］，认为这可能是由于T细胞对Aβ肽产生耐受，导致对B细胞的辅助作用下降，不足以产生足够的和有效的抗体以清除体内的Aβ，从而导致老年斑的形成。

从血清中纯化的Aβ自身抗体是多克隆性的，可能含有大量的与Aβ肽有不同亲和力的抗体［14］。虽然Du等［14］用免疫沉淀法证明亲和纯化的Aβ自身抗体能与人工合成的可溶性的Aβ肽结合，但是这些抗体能否和含有大量不溶性Aβ且具有β折叠结构的老年斑结合，没有进一步探索。本实验分别用AD、VD及HC血清的纯化抗体与T g2576鼠的脑片孵育，发现AD、VD和HC的抗体均不能识别脑片中的老年斑，显示出与老年斑的低亲和力。因此推测AD病人的体内很可能存在产生Aβ自身抗体的特异性的免疫机制异常。这些抗体虽然可以结合可溶性的Aβ肽，但是却不能识别老年斑。目前有研究认为人体（包括各个年龄组的正常人群[15]）内出现的Aβ抗体并不是针对老年斑而是针对外周Aβ，如血小板产生的Aβ［6］，因此可以理解这些抗体并不能特异性的识别老年斑。

用Aβ肽或Aβ单克隆抗体接种AD转基因鼠都可以导致鼠脑内Aβ的减少及老年斑的清除［17］。其机制可能有抗体抑制Aβ折叠结构的形成、增加Aβ纤维的解聚并激活小胶质细胞清除Aβ［18］，以及通过外周降解可溶性的Aβ肽从而使中枢和外周的Aβ平衡破坏，使中枢内的Aβ流向外周，达到清除脑内Aβ的目的［19］。但是在AD病人体内，自身抗体的病理生理作用仍然不清楚。这些低水平、低亲和力的抗体是否通过外周降解途径降解Aβ还是有别的作用机制或临床意义仍然需要进一步研究。

［1］Shayan G1,Adamiak B,Choe LH,et al.Longitudinal effects of intravenous immunoglobulin on Alzheimer's cerebrospinal fluid proteome［J］.Electrophoresis,2014,22:13-4.

［2］XuS,GaskinF.Increasedincidenceofanti-beta-amyloid autoantibodies secreted by Epstein-Barr virus transformed B cell lines from patients with Alzheimer's disease［J］.Mech Ageing Dev, 1997,94(1/3):213-22.

［3］Hyman BT,Smith C,Buldyrev I,et al.Autoantibodies to amyloidbeta andAlzheimer's disease［J］.Ann Neurol,2001,49(6):808-10.

［4］Morgan D,Diamond DM,Gottschall PE,et al.A beta peptide vaccinationpreventsmemorylossinananimalmodelof Alzheimer's disease［J］.Nature,2001,408(6815):982-5.

［5］Check E.Nerve inflammation halts trial for Alzheimer's drug［J］. Nature,2002,415(6871):462.

［6］FerrerI,BoadaRoviraM,SánchezGuerraML,etal. Neuropathologyandpathogenesisofencephalitisfollowing amyloid-beta immunization in Alzheimer's disease［J］.Brain Pathol, 2004,14(1):11-20.

［7］金伯泉.细胞和分子免疫学实验技术［M］.第四军医大学出版社, 2002:18-9.

［8］李少兵,汪华侨,林贤,等.接种Aβ_(42)全肽疫苗恒河猴的特异性体液免疫应答［J］.细胞与分子免疫学杂志,2005,21(2):202-4.

［9］段金海,徐书雯,莫建伟,等.Alzheimer患者血清中抗Aβ42自身抗体的纯化及鉴定［J］.细胞与分子免疫学杂志,2009,25(1):53-4,57.

［10］段金海,徐书雯,莫建伟,等.人抗Aβ42自身抗体的纯化及鉴定［J］.解剖学研究,2011,33(3):172-5.

［11］Selkoe DJ.Clearing the brain's amyloid cobwebs［J］.Neuron,2001, 32(2):177-80.

［12］MonsonegoA,MaronR,ZotaV,etal.Immune hyporesponsiveness to amyloid beta-peptide in amyloid precursor protein transgenic mice:implications for the pathogenesis and treatment of Alzheimer's disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2001, 98(18):10273-8.

［13］Trieb K,Ransmayr G,Sgonc R,et al.APP peptides stimulate lymphocyte proliferation in normals,but not in patients with Alzheimer's disease［J］.NeurobiolAging,1996,17(4):541-7.

［14］Du Y,Dodel R,Hampel H,et al.Reduced levels of amyloid betapeptide antibody in Alzheimer disease［J］.Neurology,2013,57(5): 801-5.

［15］杨志勇,汪华侨,张革,等.国人外周血抗β-淀粉样蛋白抗体水平的依龄性变化［J］.中山大学学报:医学科学版,2005,26(2):125-8.

［16］Di Luca M,Colciaghi F,Pastorino L,et al.Platelets as a peripheral district where to study pathogenetic mechanisms of alzheimer disease:the case of amyloid precursor protein［J］.Eur J Pharmacol, 2000,405(1/3):277-83.

［17］马晋,段金海,邹俊涛,等.人源化抗Aβ抗体治疗APP/PS1转基因鼠的实验研究［J］.新医学,2014,45(2):95-8.

［18］Mclaurin J,Cecal R,Kierstead ME,et al.Therapeutically effective antibodies against amyloid-beta peptide target amyloid-beta residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis［J］.Nat Med,2002,8(11):1263-9.

［19］Demattos RB,Bales KR,Cummins DJ,et al.Brain to plasma amyloid-beta efflux:a measure of brain amyloid burden in a mouse model ofAlzheimer's disease［J］.Science,2002,295(5563):2264-7.

Reduced low-affinity anti-β-amyloid autoantibodies in serum from Alzheimer’s disease

DUAN Jinhai1,XU Shuwen1,MO Jiannwei1,XIAO Hao1,Mo Sijie2,HU Tao21Neurology Department,Guangdong General Hosptial(Guangdong Academy of Medical Sciences).Guangdong Institute of Geriatrics.Guangdong Institute of Neurosciences,Guanzhou 510080,China;2Nanhai welfare centre,Nanhai City,foshan 528226,China

ObjectiveTo investigate the characterization of anti-Aβ autoantibodies in AD patients and affinity ability of autoantibodies stainning the Aβplaques in vitro.MethodsELISA was performed to detect levels of naturally occuring anti-Aβautoantibodies in surum from AD patients,vascular dementia and age-macthed healthy controls.Immunohistochemistry assay was employed to confirm the affinity abillity of anti-Aβautoantibodies stainning the Aβ plaques in vitro.ResultsNaturally occuring anti-Aβautoantibodies in surum from AD patients was significantly lower than those from vascular dementia and healthy controls.The autiantibodies levels were independent of gender,age and MMSE scores in AD patients. Autoantibodies purified from healthy individuals and vascular dementia patients could readily stain the Aβplaques in transgenic mouse Tg2576,while those from AD patients could not.ConclusionCompared with vascular dementia and healthy controls,AD patients have obviously lower anti-Aβautoantibodies which could not stain Aβplaques in transgenic mouse and showed a low-affinity ability with Aβplaques in vitro.The petential pathophysiological function of autoantibodies in AD patients needs futher study.

Alzheimer's disease;Vascular dementia;anti-Aβ autoantibody

2014-05-23

广东省自然科学基金（7300973，S2012010009108）；广东省科技计划项（2010B031600167）

段金海，副主任医师，博士，电话：020-83827812-70711，E-mail: duanjh888@hotmail.com