李书华，陈婷婷，刘谕昆，李灏，陈艺瑛，张雅洁

临床研究

重组腺病毒载体pDCpDC316316-hIL
--hIL-2424的构建及病毒滴度测定

李书华，陈婷婷，刘谕昆，李灏，陈艺瑛，张雅洁

广州医科大学，广东广州510182

目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24，并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24，在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox（delta）E1，3Cre共转染293细胞，包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24，经HEK293细胞扩增，TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达hIL-24基因的重组腺病毒载体（pDC316-hIL-24），获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体（pDC315-hIL-24）的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。

hIL-24；重组腺病毒载体；病毒滴度；pDC316-hIL-24

hIL-24是由哥伦比亚大学Jiang等［1］于1995年从人黑色素瘤细胞HO-1中分离获得的一种新基因，现在又命名为黑色素瘤分化相关基因-7（mda-7）。近年来的研究发现该基因还能促进其他多种癌细胞的生长抑制，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤、胰腺癌等，并可抑制血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡。相对于其它抗肿瘤基因，hIL-24是唯一的具有杀死肿瘤细胞而对正常细胞没有任何毒性作用的细胞因子［2-5］，从而具有极大的临床抗肿瘤应用价值。

AdMax包装系统是由Frank教授建立的重组腺病毒表达载体，通过AdMax包装系统构建重组腺病毒，具有操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高而且目的基因的表达水平高等特点，因而已逐渐代替目前最普及的AdEasy系统。本实验通过构建含人hIL-24基因的重组腺病毒pDC316-hIL-24表达载体，扩增表达hIL-24基因的重组腺病毒，通过感染肿瘤细胞并大量表达hIL-24蛋白，为进一步观察hIL-24基因抗肿瘤作用奠定基础

1 材料和方法

1.1 腺病毒和细胞株

AdMax重组腺病毒载体系统［包括穿梭质粒pDC316-EGFP以及E1、E3区缺失的5型腺病毒辅助大质粒pBHG loxΔE1，3Cre］购自加拿大Microbix。HEK293细胞及A549肺腺癌细胞株购为广州医科大学病理教研室保存质粒，PMD-18-T购自TAKARA。

1.2 主要试剂

低相对分子质量蛋白标准购自Takara威佳生物工程公司，限制性内切酶HindⅢ和BglⅡ快速连接试剂盒（DNA ligation kit）购于New England Biolabs；质粒小样提取试剂盒（QIAprep MiniprepSystem）、胶回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction）及PolyFect Transfection Reagent为Qiagen的产品；1640培养基、DMEM培养基及胎牛血清均为美国Gibco产品。

1.2.1 HEK293细胞培养及总RNA的提取采用DMEM培养液及10％FBS常规培养HEK293细胞，每2 d换液传代。取1×106/ml对数生长期的HEK293细胞提取总RNA，按TRIZOL RNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 逆转录cDNA第一链合成取RNA 1 μg，Oligo DT 1 μg，然后加入10×RAV-2 Reverse Transcriptaseuffer 2 μl，l RNase inhibitor 1 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，AMV逆转录酶1 L，l和DEPCH2O 5.4 Ll。反应总体积为20 μl，l混匀放置于30℃10 min，50℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，最后于-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增hIL-24基因全编码区(cDNA)序列参考GenBank NM006850序列设计引物，引物含hIL-24基因全编码区。上游引物：5'-CG AGATCTATGAATTT'TCAACAGAGGCTG-3'下游引物：5'-CCC GGATCCTTATCAGAGCTTTAGAATT-3'。引物由广州瑞真生物工程公司合成。上下游引物两端分别加有BglⅡ和HindⅢ酶切位点，扩增片段大小为621 bp，包含完整的IL-24基因cDNA。PCR反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，72℃延伸10 min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段。

1.2.4 hIL-2基因序列测定及酶切鉴定将hIL-24基因用T4Ligase连接于PMD18-T载体上，转化TG1感受态细菌，用X-gal和IPTG进行蓝白筛选，挑选白色阳性克隆摇菌，抽提质粒，双酶切鉴定后送测序。

1.2.5 重组pDC316-EGFP-IL-4腺病毒载体的构建用BglⅡ和HindⅢ内切酶同时对腺病毒载体pDC316-EGFP和hIL-24片段进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收；将回收的载体片段和目的基因cDNA用T4Ligase 16℃连接过夜，直接取5 μl连接产物转化TG1感受态细菌，用含氨苄青霉素LB培养基平板进行筛选，挑出3个克隆，摇菌过夜，抽提质粒、双酶切鉴定正确的重组腺病毒载体命名为pDC316-EGFP-hIL-24。

1.2.6 重组腺病毒pDC316-hIL-24的包装用质粒抽提试剂盒提取病毒包装系统中的质粒DNA，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度后进行质粒转染过程［6-10］。将穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-4和辅助质粒pBHGlox （delta）E1，3Cre通过Lipofectamine2000共转染HEK293细胞，观察细胞生长状况，待大部分细胞出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)，收集细胞，-70℃/ 37℃反复冻融，收集病毒上清-70℃保存。

1.2.7 重组腺病毒pDC315-hIL-24的扩增、纯化将生长状态良好的HEK293细胞4倍稀释后转入细胞培养瓶中，加入重组腺病毒pDC315-hIL-24收获的粗提液继续培养，待大部分细胞出现典型的CPE，收集病毒上清液，再次扩增，将混悬液3000 r/min离心10 min，弃上清，细胞沉淀用Tris缓冲液重悬，反复冻融3次，6000 r/min离心，取上清，用DNase酶消化后，用0.45 μm的滤膜过滤，然后进行柱纯化，-70℃保存。

1.2.8 重组腺病毒pDC315-hIL-24感染性滴度（TCID50）测定在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1~10-10。将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100µl。在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到3×105/ml。将96孔板置于37℃CO2培养箱中培养，10 d后观察细胞病变现象，并对CPE孔进行计数，计算每行的阳性率。病毒滴度计算按（Karber法）：滴度T＝101+d（s-0.5）进行。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增hIL-24基因cDNA及序列测定

RT-PCR扩增hIL-24基因cDNA片段，用1％琼脂糖凝胶电泳观察，在621 bp处可见目的基因片段（图1），扩增出的片段与预计目的片段大小一致。将回收的目的片段连接到PMD18-T载体，测序结果进一步证实克隆的序列完全正确（图2）。

图1 RT-PCR产物电泳图Fig.1 Identification the hIL-24 gene by PCR, 1:hIL-24；2:DNAMARKER

2.2 重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24的酶切鉴定

构建出的pDC316-EGFP-hIL-24重组质粒用HinglⅡ和HindⅢ双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳观察，发现在621 bp和3.9 kb处分别可见目的基因和载体条带，表明hIL-24基因已正确构建到腺病毒穿梭质粒中，见图3。

图2 PMD18-T-hIL-24测序结果Fig.2 Sequence of PMD18-T-hIL-24 DNAdectection.

图3 pDC316-EGFP-hIL-24质粒经BglⅡ及HindⅢ双酶切Fig.3Identification the pDC316-EGFP-hIL-24 byBglII andHindIII enzyme.1:pDC316-EGFP-hIL-24,2:DNAMarker.

2.3 重组腺病毒的构建

线性化重组穿梭质粒与辅助质粒pBHGlox（delta） E1，3Cre共转染HEK293A细胞后，在倒置显微镜下观察，可见转染后的细胞出现细胞病变效应（CPE）：明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落。第7天出现明显病毒噬斑（图4），提示腺病毒构建成功并在HEK293细胞内复制。

图4 出现CPE反应的293细胞Fig.4 293 Cells with a CPE response(Original magnification:×10).

2.4 重组腺病毒的鉴定

通过冻融法裂解细胞后，收取病毒液并感染HEK293细胞72 h后，在倒置荧光显微镜下观察荧光，发生同源重组的病毒，可见报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达（图5），提示重组腺病毒感染细胞并HEK293细胞内进行了表达。收取病毒液进行PCR鉴定结果显示：取病毒DNA1 μl为模板，通过PCR方法扩增出约621 bp的特异性片段，其大小与阳性对照相符，表明mda-7/IL-24基因已克隆入重组腺病毒（图6，7）。

图5 pDC316 hIL-24的表达的绿色荧光蛋白Fig.5 Identification of gfp(O riginal magnification:×100).

图6 Ad.mda-7.egfp的PCR鉴定Fig.6 identification of Ad.mda-7.egfp by PCR M:DNAMarker 2000;1:PCR positive.

图7 Ad.IL-24.egfp图谱Fig.7 Plasmid map of Ad.IL-24.egfp.

2.5 重组腺病毒滴度测定

收集产生感染性重组病毒颗粒的HEK293细胞，在37℃/-80℃条件下反复冻融3次，离心沉淀后，取部分病毒上清再次感染HEK293细胞以扩增重组病毒。如此反复进行多次可获得高滴度的重组腺病毒。TCID50法测定所得病毒滴度为2.5×1010U/ml。

3 讨论

白细胞介素24（hIL-24）是近年来发现的一种新型肿瘤抑制基因，现在又命名为黑色素瘤分化相关基因-7 （mda-7）。近年来的研究发现该基因还能促进其他多种癌细胞的生长抑制和凋亡，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤、胰腺癌等。相对于其它抗肿瘤基因，hIL-24在抗瘤抑瘤及降低毒副作面用两具有明显的优势。首先，hIL-24的抗肿瘤具备恶性肿瘤选择性。该基因对正常表皮细胞，肺成纤维细胞，乳腺细胞，前列腺和肺上皮细胞，星形胶质细胞，内皮细胞及黑色素细胞等正常细胞均无任何毒副作用；其次，hIL-24用于癌症治疗不受肿瘤细胞的抑癌基因状态的影响，相对于p53等抑癌基因来说，hIL-24抑制癌细胞的增长和促进凋亡与这些癌细胞中其它抑癌基因的状态无关(p53，Rb，或pl6ink4)，因而可以更稳定地发挥抗肿瘤作用；同时，hIL-24是一个前Thl因子(pro-Thlcytokine)，能激活STAI产生肿瘤免疫，抗血管生成和受体介导的细胞毒性［6-8］；最后，hIL-24蛋白还可以大大增强肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，从而起到杀伤肿瘤细胞的效果。hIL-24是IL-10家族中唯一的具有杀死肿瘤细胞而对正常细胞没有任何毒性作用的细胞因子［2-4］，从而具有极大的临床抗肿瘤应用价值。

本实验采用的pDC316载体属于腺病毒AdMax，构建重组腺病毒表达载体代替最普及的AdEasy系统。AdMax包装系统是由Frank教授建立，由加拿大Microbix公司经销。与目前使用最普及的腺病毒AdEasy系统相比，腺病毒AdMaxTM系统具有操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高（一般大于104 vp/ cell）、目的基因的表达水平高（因为mCMV启动子比hCMV启动子强若干倍）等优势［9-10］。AdMax系统只需要2~4周就能完成从质粒构建到重组出毒，AdMax系统因在真核细胞内重组出毒，出毒成功率大于98％（其中95％的克隆含有目的基因），而AdEasy系统的出毒成功率只有18％~34％［11］。我们将重组的含有目的基因hIL-24片段的穿梭质粒载体pDC316-hIL-24和骨架质粒pBHGloxΔE1，3Cre，共同转染至HEK293细胞，包装产生重组腺病毒pDC316-hIL-24，病毒活性单位为2.5× 1010U/ml，而常用的AdEasy包装系统产生的病毒活性单位通常只有107~108U/ml，AdMax系统包装的病毒活性显然高于AdEasy包装系统。本研究构建的腺病毒pDC316-hIL-24为进一步开展hIL-24基因功能的深入研究和重组腺病毒转基因治疗打下基础。

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Construct ion of recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and the detection of viral titer

LI Shuhua,CHEN Tingting,LIU Yukun,LI Hao,CHENG Yiying,ZHANG Yajie Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,China

ObjectiveTo onstruct recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and detect the viral titer.MethodsTotal mRNA was ex tracted from HEK293 cells,and specific primer pairs were designed in order to clone human interleukin-24(hIL-24)gene cDNA by RT-PCR method.hIL-24 gene was directional constructed into shuttle plasmidr(pDC316-EGFP)after digestion by restrictive endoenzymeBglII,andHindIII.HEK293 cells were co-transfected with the constructed recombinant shuttle plasmid pDC316-EGFP and large adenovirus helper plasmid pBHGlox(delta)E1，3Cre in mediation of liposome。The constructed recombinant adenovirus vector was named pDC316-hIL-24.Recombinant adenovirus was amplificated and purificated in HEK293 ce lls.ResultsRecombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 was constructed successfully and high titer recombinant adenovirus was obtained.ConclusionThe construction of recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and the obtain of recombinant adenovirus will lay down the basis for developing gene therapy of cancer.

hIL-24;recombinant adenovirus vector;viral titer;pDC316-hIL-24

2014-04-19

广东省医学科研基金项目（A2013244）；教育部博士点基金项目博导类课题（20134423110001）；广东省自然科学基金项目（S2012010010181）；广州市科技计划项目（2014Y2-00171）；广州市教育系统创新学术团队项目（13C06）

李书华，博士，讲师，主要从事肿瘤生物治疗研究

张雅洁，博士，教授，博士生导师，E-mail:yajie.zhang@163.com