王洪志，乔晓莉，刘 勇，李婉晴

(天津市南开医院，天津300100)

实验研究

两种溶剂提取大黄蒽醌类成分的变化*

王洪志，乔晓莉，刘 勇，李婉晴

(天津市南开医院，天津300100)

目的:考查以热水(100℃，即水煎煮后下)和乙醇为提取溶剂对大黄蒽醌类成分提取的影响。方法:采用高效液相色谱法，以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种成分含量之和为指标，考查不同时间热水和不同浓度乙醇煎煮大黄蒽醌类成分的变化。结果:以热水提取时，煎煮25 min大黄游离型蒽醌和总蒽醌含量最高;乙醇提取时，50%乙醇煎煮35 min总蒽醌和结合型蒽醌含量最高。结论:大黄热水煎煮以25 min为宜，而醇提以50%乙醇提取35 min为宜，总蒽醌转移率分别达到38%和48%。

大黄，蒽醌类成分，水提，醇提

大黄为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim ex Balf)或药用大黄(Rheum officinale Baill)的干燥根及根茎［1］，主要有效成分为几种葡萄糖苷和苷元，含量约3%～5%，苷元主要是蒽醌类衍生物，包括大黄酚(chrysophanol或chrysophanic acid，C15H10O4)、大黄素(emodin或rheum emodin，C15H10O5)、芦荟大黄素(Aloe－emodin，C15H10O5)、大黄酸(Rhein，C15H8O6)和大黄素甲醚(physcion或parietin、rheochrysidin，C16H12O5)［2，3］。其中游离蒽醌难溶或不溶于水，可溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，而结合蒽醌及苷亲水性强，易溶于水、乙醇，难溶于乙醚、氯仿及其他有机溶剂，文献报道常采用水或乙醇为溶剂对大黄药材进行提取［4，5］。由于大黄致泻的主要成分为结合型蒽醌类化合物，游离型蒽醌泻下作用较弱，临床作为泻下药时须注明后下(在群药煎好以前5～15 min加入煎煮)。本实验以热水(100℃)煎煮模仿水煎煮后下，以热水和乙醇为溶剂，考查两种溶剂对大黄蒽醌类成分提取的影响，以期阐明临床煎煮大黄的最佳时间以及大成产过程中大黄的最佳提取时间，从而对大黄的应用和生产提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器LC－10A型高效液相色谱仪，岛津SPD－10A紫外检测器，AUTO SCIENCE AT－330柱温箱; KQ 3200超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂);RE－52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药大黄(天津市中药饮片厂有限公司，产地:甘肃，批号1206038)。对照品购自中国药品生物制品检定所，芦荟大黄素(批号110795－200605)、大黄酸(批号0757－200206)、大黄素(批号110756－200110)、大黄酚(批号110796－201017)、大黄素甲醚(批号110758－200610)。盐酸(分析纯，天津化学试剂三厂)、磷酸(分析纯，天津江天化学技术有限公司)、三氯甲烷(分析纯，天津江天化学技术有限公司)、甲醇(色谱纯，天津基准化学试剂有限公司)，水为娃哈哈饮用纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:AGT C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流动相:甲醇－0.1%磷酸(85∶15);检测波长:254 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:40℃。

2.2 样品处理

2.2.1 加热水不同煎煮时间样品的制备分别取大黄饮片5份，每份5 g，置于500 ml烧瓶中，加热水(水煮沸至100℃)加热回流3次，每次100 ml，每份3煎煎煮时间均相同，分别为15、20、25、30和35 min，合并3煎煎液，减压浓缩至50 ml，即得。

2.2.2 不同浓度乙醇煎煮样品的制备分别取大黄饮片4份，每份5 g，置于500 ml烧瓶中，加不同浓度乙醇(室温)加热回流3次，每次100 ml，每煎25 min，4份乙醇浓度分别为30%、50%、70%和95%，合并3煎煎液，减压浓缩至50 ml，即得。

2.2.3 50%乙醇不同煎煮时间样品的制备分别取大黄饮片5份，每份5 g，置于500 ml烧瓶中，加50%乙醇(室温)加热回流3次，每次100 ml，每份3煎煎煮时间均相同，分别为15、20、25、30和35 min，合并3煎煎液，减压浓缩至50 ml，即得。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品，加甲醇制备混合对照品溶液(每1 ml中含芦荟大黄素14 μg、大黄酸12 μg、大黄素10 μg、大黄酚11 μg、大黄素甲醚20 μg)。

2.3.2 游离蒽醌样品溶液的制备精密量取大黄煎煮样品2 ml于100 ml圆底烧瓶中，减压浓缩至干，加甲醇25 ml，加热回流1 h，放冷，滤过，用少量甲醇洗涤容器，收集滤液，减压浓缩并定容至10 ml，即得。

2.3.3 总蒽醌样品溶液的制备精密量取大黄煎煮样品2 ml于100 ml圆底烧瓶中，减压浓缩至干，加甲醇25 ml，加热回流1 h，放冷，滤过，用甲醇适量洗涤容器，收集滤液，减压浓缩至干，加8%盐酸10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并定容至10 ml，即得。

结合型蒽醌含量=总蒽醌含量－游离型蒽醌含量，色谱图见图1。

2.4 标准曲线的制备精密称取对照品适量，加甲醇溶解并定容，得到芦荟大黄素浓度为3.5、7、14、28和56 μg/ml，大黄酸浓度为2、4、12、24和48 μg/ml，大黄素浓度为2、5、10、20和40 μg/ml，大黄酚浓度为1.1、3.3、11、22和44 μg/ml，大黄素甲醚浓度为2、5、20、40和80 μg/ml的对照品溶液的系列溶液。将上述溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定，以对照品峰面积值(Y)对其相应浓度(X)做线性回归，得回归方程见表1，结果表明芦荟大黄素在3.5～56 μg/ml范围内线性关系良好，大黄酸在2～48 μg/ml范围内线性关系良好，大黄素在2～40 μg/ml范围内线性关系良好，大黄酚在1.1～55 μg/ml范围内线性关系良好，大黄素甲醚在2～80 μg/ml范围内线性关系良好。

图1 对照品(A)游离蒽醌样品(B)总蒽醌样品(C)HPLC色谱图

表1 各成分回归方程

2.5 精密度试验取混合对照品溶液(芦荟大黄素14 μg/ml、大黄酸12 μg/ml、大黄素10 μg/ml、大黄酚11 μg/ml、大黄素甲醚20 μg/ml)，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，测定峰面积值，得芦荟大黄素峰面积RSD为1.33%，大黄酸峰面积RSD为1.55%，大黄素峰面积RSD为1.25%，大黄酚峰面积RSD为1.38%，大黄素甲醚峰面积RSD为1.06%。

2.6 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6和8 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，得芦荟大黄素峰面积RSD为1.03%，大黄酸峰面积RSD为1.34%，大黄素峰面积RSD为1.14%，大黄酚峰面积RSD为1.08%，大黄素甲醚峰面积RSD为1.27%，表明样品在8 h内稳定性良好。

2.7 回收率试验取同一份样品，精密量取1 ml，共6份，精密称定，置圆底烧瓶中，加入一定量的对照品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果芦荟大黄素平均回收率为99.49%，RSD为0.32%;大黄酸平均回收率为99.32%，RSD为0.56%;大黄素平均回收率为99.31%，RSD为0.44%;大黄酚平均回收率为99.59%，RSD为0.22%;大黄素甲醚平均回收率为99.27%，RSD为0.16%。结果见表2。

2.8 样品的测定按“2.2”项下样品处理方法制备样品，按“2.3.2”和“2.3.3”项下溶液制备方法制备样品溶液，“2.1”项下色谱条件测定含量，结果(以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚之和计)见表3－5和图2。

2.9 总蒽醌的含量及转移率根据“2.8”项下样品测定结果，取大黄药材，按“2.2”项下样品处理方法制备大黄热水提取样品(3煎，每煎25 min)以及大黄醇提取样品(50%乙醇3煎，每煎35 min)。另取大黄粉末(过四号筛)0.15 g，按“2.3.3”项下方法制备样品溶液，测定以上三种样品中总蒽醌含量，并计算转移率，结果见表6。

表2 回收率试验(n=6)

表3 加热水不同煎煮时间样品中蒽醌类成分的含量(n=3)

表4 不同浓度乙醇煎煮样品中蒽醌类成分的含量(n=3)

表5 50%乙醇不同煎煮时间样品中蒽醌类成分的含量(n=3)

表6 样品中总蒽醌的含量及转移率(n=2)

图2 两种溶剂提取大黄蒽醌类成分的变化

3 讨论

热水(100℃)提取时，煎煮35 min结合蒽醌含量(0.449 2%)稍高于煎煮25 min(0.429 3%)，而煎煮25 min大黄总蒽醌和游离蒽醌含量最高(总蒽醌0.787 0%，游离蒽醌0.361 2%)，因此将25 min作为煎煮时间考查不同浓度乙醇提取时大黄蒽醌类成分的含量变化，结果提取时间相同(25 min)条件下，50%乙醇提取游离蒽醌(0.479 8%)低于70%乙醇提取(0.512 8%)，总蒽醌和结合蒽醌含量最高(总蒽醌0.873 9%，结合型蒽醌0.394 1%)，继续考查相同浓度乙醇(50%)不同提取时间大黄蒽醌类成分的含量变化，结果煎煮35 min游离蒽醌(0.536 1%)低于煎煮30 min(0.611 1%)，但总蒽醌和结合蒽醌在煎煮30 min时含量最高(总蒽醌0.978 1%，结合型蒽醌0.442 1%)。综上，大黄水煎煮后下以25 min为宜，总蒽醌转移率为38.06%;而醇提以50%乙醇提取35 min为宜，总蒽醌转移率为48.37%。

1中国药典［S］.2010年版第一增补本.2010:77

2南京中医药大学.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，2003:102

3徐翔，郦柏平，张慧芬.大黄的研究进展［J］.上海中医药杂志，2003，37(4):56

4张永红.影响大黄提取液中蒽醌含量的条件探讨［J］.兰州医学院学报，1996，22(2):9

5魏凤玲，齐敏超，钟加胜.大黄蒽醌类成分提取工艺优选［J］.中国中药杂志，1998，23(10):609

Study on effect of water and alcohol extracting process to anthraquinone content in Rhubarb

Wang Hongzhi，Qiao Xiaoli，Liu Yong，Li Wanqing
(Tianjin Nankai Hospital，Tianjin 300100)

Objective:To study the effect of water(100℃)and alcohol extracting process to anthraquinone content in Rhubarb.Methods:HPLC method was used to determine the contents of Aloe－emodin，Rhein，Rheum emodin，Chrysophanol and Physcion，choosing hot water and different concentration of alcohol as the solvent，to investigate the content of total，conjugated，and nomadic anthraquinone under different extracting time.Results:The content of total and nomadic anthraquinone were highest when extracted 25 minutes by hot water，while ethanol was used as solvent，50%of ethanol extracted 35 minutes were the best conditions.Conclusion:25 minutes was the suitable extracting time for decoction of Rhubarb by hot water，and 50%alcohol，extracting 35 minutes were proper ethanol extracting conditions，and the transfer rate of total anthraquinone reached 38%and 48%respectively.

Rhubarb，anthraquinone content，water extracting process，alcohol extracting process

R927.1

A

1006-5687(2014)01-0001-04

2013-08-30