香连化滞片质量标准的研究*

2014-06-05李文艳

天津药学 2014年1期

关键词：薄层芍药黄芩

张茉，周军，李文艳

(1.天津市药品检验所，天津300070;2.天津隆顺榕发展制药有限公司，天津300232)

香连化滞片质量标准的研究*

张茉1，周军1，李文艳2

(1.天津市药品检验所，天津300070;2.天津隆顺榕发展制药有限公司，天津300232)

目的:完善香连化滞片的质量控制方法。方法:采用薄层色谱方法鉴别香连化滞片中的陈皮、黄连;采用高液相色谱法测定其中芍药苷和黄芩苷的含量。芍药苷含量测定色谱条件:采用Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以70%乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长230 nm;黄芩含量测定色谱条件:采用phenomenex luna－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.1)为流动相，检测波长276 nm。结果:在选定的薄层色谱条件下，层析斑点清楚，分离效果较好;HPLC方法学考查显示芍药苷在0.011 73～2.932 0 μg范围内线性良好(r=0.999 9)，平均加样回收率为99.06%(n=6)，RSD为0.71%;黄芩苷在0.022 316～5.579 0 μg范围内线性良好(r=0.999 9)，平均加样回收率为98.82%(n=6)，RSD为0.70%。结论:该方法快捷、准确，可作为该制剂的质量控制标准。

香连化滞片，薄层色谱法，高效液相色谱法，芍药苷，黄芩苷

香连化滞片由白芍、当归、黄芩、陈皮、黄连等12味中药组成，具有调中化滞，止痛止痢的功效，用于红白痢疾，里急后重，肚腹绞痛，停滞不消。其原标准收载于卫生部《药品标准中药成方制剂第十五册》，标准号为WS3－B－2937－98。在2010—2011年度国家药品标准提高工作中，对其质量标准进行了提高和完善。在原标准基础上，增加了陈皮的薄层鉴别方法，修订了黄连的薄层鉴别;增加了芍药苷和黄芩苷的含量测定方法。修订后的质量标准提高了药品的质量控制指标，可更好的控制香连化滞片的产品质量。

1 仪器与试药

SHIMADZU LC－20AD高效液相色谱仪，LC－So-lution工作站。黄连对照药材(中国药品生物制品检定所，批号913－9905)，陈皮对照药材(中国药品生物制品检定所，120969－200808)，芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110736－201136，供含量测定用，纯度96.0%)，黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110715－201117，供含量测定用，纯度91.7%)。香连化滞片样品为国内某企业生产(批号为110406、110508、110509、110717)。乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 陈皮的薄层鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备取样品粉末2 g，加甲醇40 ml，超声处理40 min，滤过，取滤液1 ml备用，剩余滤液蒸干，残渣加水25 ml使溶解，加乙酸乙酯提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，加水洗涤2次，每次20 ml，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2 对照药材溶液的制备取陈皮对照药材0.5 g，加甲醇10 ml，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备按处方配比，取处方药材2 g(因处方中陈皮、青皮、枳实同时含橙皮苷等黄酮类成分，因此采用缺陈皮、青皮、枳实阴性对照)，按照供试品项下的方法提取，以缺陈皮、青皮、枳实的样品溶液为阴性样品溶液1，以缺青皮、枳实的样品溶液为阴性样品溶液2。

2.1.4 薄层色谱条件及结果照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各2～4 μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯(1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。结果见图1。

2.2 黄连的薄层色谱

2.2.1 供试品溶液的制备取“2.1.1”项下备用的甲醇提取液作为供试品溶液。

2.2.2 对照药材溶液的制备取黄连对照药材0.25 g，加甲醇25 ml，超声处理20 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备按处方配比，取处方药材2 g(黄连除外)，按照供试品项下的方法提取，作为阴性对照溶液。

2.2.4 薄层条件及结果照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各1～2 μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水－三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，置用浓氨试液饱和10 min的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯下(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。见图2。

图1 陈皮薄层色谱图

图2 黄连薄层色谱图

表1 芍药苷梯度洗脱系统

2.3 芍药苷含量测定

2.3.1 色谱条件Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;以70%乙腈为流动相A，水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱;柱温30℃;流速1.0 ml/min;检测波长230 nm;理论板数按芍药苷峰计算应不低于5 000。

2.3.2 溶液的制备

2.3.2.1 对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 ml中含22 μg的溶液，即得。

2.3.2.2 供试品溶液的制备取样品(批号110508)适量，研细，取0.2 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 ml，称定重量，置水浴上加热回流30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心5 min (3 000 r/min)，取上清液，滤过(0.45 μm微孔滤膜)，取续滤液，即得。

2.3.2.3 阴性对照溶液的制备按处方取除白芍的各味药材，按制法制得样品，再按“2.3.2.2”供试品溶液的制备方法，制得白芍阴性对照溶液。

2.3.3 阴性对照试验精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，供试品中所含其他药材和辅料，均不干扰芍药苷的测定。见图3。

图3 对照品(A)供试品(B)阴性样品(C)HPLC色谱图

2.3.4 线性关系考查取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为每1 ml中含芍药苷分别为1.173 0、5.865 0、11.730 0、29.320 0、146.600 0和293.200 0 μg的对照品溶液，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件分析，分别测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程: Y=－4 048.91+1 477 587.37 X(r=0.999 9，n=6)。结果表明，芍药苷在0.011 73～2.932 0 μg范围内线性关系良好。

2.3.5 重复性试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.2 g，精密称定，共取6份，精密加入70%甲醇25 ml，按“2.3.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，依“2.3.1”项下色谱条件分析，样品中芍药苷含量平均值为2.781 0 mg/g，RSD为1.15%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.3.6 精密度试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.2 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，按“2.3.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定芍药苷峰面积，样品中芍药苷峰面积平均值为341 654，RSD为0.95%(n=6)。

2.3.7 稳定性试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.2 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”供试品溶液制备方法操作，按“2.3.1”项下色谱条件分析，分别在0、2、4、8、12、18和24 h进样测定1次，测得样品中芍药苷峰面积平均值为339 708，RSD为1.16%(n=7)。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.8 回收率试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.1 g，精密称定，共6份，分别精密加入浓度为0.011 727 mg/ml的芍药苷对照品70%甲醇溶液25 ml，按照“2.3.2.2”项下供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分析。结果芍药苷平均加样回收率为99.06%，RSD为0.71%(n=6)。结果见表2。

表2 芍药苷加样回收试验(n=6)

2.3.9 样品测定取同一厂家4个不同批号的样品，按照“2.3.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.3.1”项下色谱条件分析，测定样品中芍药苷含量。结果见表3。

2.4 黄芩苷含量测定

2.4.1 色谱条件phenomenex Luna C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)色谱柱;以甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.1)为流动相;柱温30℃;流速1.0 ml/min;检测波长276 nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5 000。

表3 芍药苷样品含量测定

2.4.2 溶液的制备

2.4.2.1 对照品溶液的制备取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml中含黄芩苷24 μg的溶液，即得。

2.4.2.2 供试品溶液的制备取“2.3.2.2”项下的供试品溶液，即得。

2.4.2.3 阴性对照溶液的制备按处方取除黄芩的各味药材，按制法制得样品，再按“2.3.2.2”供试品溶液制备方法，制得黄芩阴性样品溶液。

2.4.3 阴性对照试验精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，供试品中所含其他药材和辅料均不干扰黄芩苷的测定。见图4。

2.4.4 线性关系考查取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为每1 ml中含黄芩苷分别为2.231 6、11.158 0、22.316 0、55.790 0、278.950 0和557.900 0 μg的对照品溶液，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，按“2.4.1”项下色谱条件分析，分别测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程:Y= 11 818.28+3 980 910.54 X(r=0.999 9，n=6)。结果表明，黄芩苷在0.022 316～5.579 0 μg范围内线性关系良好。

2.4.5 重复性试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.2 g，精密称定，共取6份，分别精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”供试品溶液制备操作，按“2.4.1”项下色谱条件分析，样品中黄芩苷含量平均值为5.605 5 mg/g，RSD为0.45%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.4.6 精密度试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.2 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，按“2.4.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定黄芩苷峰面积，样品中黄芩苷峰面积平均值为895 498，RSD为1.11%(n=6)。

图4 对照品(A)供试品(B)阴性样品(C)HPLC色谱图

2.4.7 稳定性试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.2 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.4.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、18和24 h进样，测定，样品中黄芩苷峰面积平均值为903 570，RSD为0.60% (n=7)。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.8 回收率试验取同一批号(110508)样品适量，研细，取0.1 g，精密称定，共6份，分别精密加入浓度为0.022 316 mg/ml的黄芩苷对照品70%甲醇溶液25 ml，按照“2.3.2.2”项下供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分析。结果黄芩苷平均加样回收率为98.82%，RSD为0.70%(n=6)。结果见表4。

表4 黄芩苷回收率试验

2.4.9 样品测定取同一厂家4个不同批号的样品，按照“2.3.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.4.1”项下色谱条件分析，测定样品中黄芩苷含量。结果见表5。

表5 黄芩苷样品含量测定

3 讨论

3.1 陈皮挥发油鉴别方法的探索

3.1.1 供试品溶液的制备取样品粉末5 g，加石油醚(30～60℃)30 ml，超声处理20 min，滤过，滤液低温蒸干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。

3.1.2 对照药材溶液的制备取陈皮对照药材0.5 g，按“3.1.1”项下供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。

3.1.3 阴性样品溶液的制备按处方配比，取处方药材5 g(陈皮除外)，按照供试品项下的方法提取，作为阴性对照溶液。

3.1.4 薄层条件及结果照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各2～6 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，分别以石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(20∶1)、石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(9∶1)、石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，均喷以5%香草醛硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视。结果供试品色谱中在与陈皮对照药材色谱相应的位置上未见同颜色的斑点。见图5。这可能是由于挥发性成分在样品储藏过程中易损失，故此鉴别方法未列入质量标准。

3.2 原质量标准中，以盐酸小檗碱对照品鉴别制剂中的黄连，专属性不强，不能排除样品中直接添加盐酸小檗碱的可能性。经过试验，改用黄连对照药材控制中的黄连，更具有专属性。故将此项鉴别改为以黄连药材为对照，作为样品中黄连的控制手段更为合理。