王 萌，叶 菁，李 晶，褚云娟，王 欣，陈 芳，刘玲侠，王勤涛

(第四军医大学口腔医院牙周科军事口腔医学国家重点实验室，陕西 西安 710032)

牙周炎是口腔最常见的疾病，菌斑是诱发牙周炎的主要原因之一，因此菌斑控制是治疗及预防牙周炎的重要措施。牙周非手术治疗的重点即在于去除菌斑，既有利于牙周组织的愈合，也利于牙周组织正常形态的恢复［1］。

目前临床上最经典、常用且疗效可靠的基础治疗器械是Gracey手工刮治器，但其对操作者的要求较高，且操作具有一定难度;而不同技术的结合应用则可相互弥补不足，提高疗效。如Nd:YAG激光，因其具有一定的灭菌效果［2－3］，且能缓解牙本质敏感等症状而被视作牙周治疗的补充手段。另外，喷砂技术因能高效去除细小的牙石及色素也被作为补充手段广泛应用于牙周治疗，但由于喷砂砂粒的特性，目前还多应用于龈上洁治中。随着喷砂技术的发展以及更光滑细微砂粒的产生，使龈下喷砂成为可能［4］。

本实验以新鲜拔除的重度牙周炎患牙为对象，分别采用单纯Gracey手工刮治、手工刮治结合激光照射、手工刮治结合龈下喷砂对根面进行处理;通过观察3种方式处理后牙根表面的粗糙程度以及牙周膜细胞在根面粘附、增殖情况的差异，探讨不同处理方式对牙根面生物学性能的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

DMEM培养液、胎牛血清、青霉素链霉素混合液(Hyclone公司，美国);胰蛋白酶(西安科昊生物工程有限公司);Ⅰ型胶原酶(BETTER公司，美国);DMSO(Sigma公司，美国)MTT(Amresco，美国)。TDZ4－WS低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);WS－CJ－2F型超净工作台(苏州泰安空气技术有限公司);二氧化碳恒温孵箱(Thermo Scientific，美国);自动酶标检测仪(Bio－tek，美国);Smart Life口腔激光治疗机(DEKA MELA公司，意大利);FT－188龈下洁牙机(EMS公司，瑞士)。

1.2 样本制备

1.2.1 离体牙选择

收集因重度牙周炎拔除的磨牙和前磨牙，用生理盐水冲洗后，从中选取57个(前磨牙20个，磨牙37个)用于实验。纳入标准:①存在龈下牙石;②邻面牙周袋及附着丧失≥6 mm，X线片示牙槽骨吸收至根尖1/3;③近6个月内未进行过牙周治疗、未服用抗生素。排除标准:①患牙根面有龋坏或缺损;②患有全身性疾病。

1.2.2 分组处理和牙根片制备

取上述57个离体牙分别在牙根标记出处理范围后，用Gracey刮治器以每个根面2 min的标准时间对所有牙齿根面进行刮治处理，要求刮治后的根面无残留软组织及牙石附着，根面平整光滑(肉眼观察)。将处理后的患牙随机分为A、B、C 3组(每组19个)，其中A组不做特殊处理(单纯刮治组)作为对照;B组各牙根面用Nd:YAG激光以20 Hz，100 mJ的能量处理2 min;C组各牙根面以中等能量进行喷砂及水流处理5 s。取上述处理完成后的所有牙齿，分别在水冷却下从邻面釉牙骨质界下2 mm处向根方切取5 mm×5 mm×1 mm的根片，每个牙选取1片较平整的根片(共57片，每组19片)浸泡于含有青霉素和链霉素的双抗PBS液中，过夜后干燥、高温高压消毒备用。

1.3 各组根片表面形态学观察

分别从每组样本中各随机抽取2片根片，用20 mL/L戊二醛液4℃下固定24 h后，乙醇梯度脱水、干燥、喷金，扫描电镜下观察根片表面形态并拍照。

1.4 各组根片表面粗糙度检测

分别从每组样本中各随机抽取2个根片，每个根片随机选择3个点用原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)进行检测;并参照 ISO1302－1992的标准，计算各组的轮廓算术平均偏差(Ra)。

1.5 不同根面处理对PDLC粘附、增殖影响的观察

1.5.1 细胞培养

选取16～25岁健康志愿者(知情同意)因正畸减数拔除的前磨牙，刮取根中1/3的牙周膜组织用组织块酶消化法进行原代细胞培养(用含100 mL/L胎牛血清的 DMEM培养液在37℃、50 mL/L CO2条件下)。每3 d换液，待细胞铺满瓶底80%时进行传代，取生长良好的4代细胞用于以下实验。

1.5.2 PDLC在各组根片粘附、增殖情况的观察

将各组所余的15个根片分别置24孔培养板中，每孔3片。然后取第4代PDLC用DMEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×10/mL后，取1 mL接种于24孔板各孔中的根片表面，37℃，50 mL/L CO2条件下进行培养。分别于培养后1、6、12 h每个时间点每组各取2个根片，PBS漂洗3遍后用20 mmol/L戊二醛液固定(4℃过夜);然后用扫描电镜观察细胞在根片上的粘附情况。各组所余9个根片继续培养，并分别于培养后1、3、5 d每组各取一孔(3个根片)终止培养;用PBS漂洗3遍后，避光条件下于每孔中各加入100μL MTT液(5 mg/mL)和100 μL培养液继续培养;4 h后弃原液，避光条件下于每孔中各加入1 mL DMSO，室温下微量震荡5 min使甲臜结晶充分溶解，然后从每孔中各吸取200 μL混合液转多至96孔板(每试样复5孔)，同时设DMSO为调零孔，用酶标仪分别检测各孔490 nm波长下的OD值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件进行统计分析，组间均数比较用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同处理组的根面形态比较

扫描电镜观察显示:单纯Gracey刮治组的根面有较多玷污层存在，局部可见明显的划痕(图1a);刮治合并激光组的根面玷污层相对较少，且呈熔融状较为平整(图1b);刮治合并喷砂组的根面几乎无玷污层，且表面光滑而平整(图1c)。

图1 不同处理组根面扫描电镜照片(×2 500)

2.2 不同处理组的根面粗糙度比较

本实验以原子力显微镜并等效采用ISO1302－1992的标准对各组根面的粗糙度进行检测(单位nm)。表面粗糙度是指加工表面具有的微小峰谷不平度，因其两波峰或两波谷之间的距离(波距)很小(难以用肉眼加以区别)，属于微观几何形状误差通常以轮廓算术平均偏差Ra评定粗糙度的大小。结果显示:单纯 Gracey刮治组的 Ra=(1.4075±0.3827)×102(图2a);刮治合并激光组的 Ra=(2.2445±0.3930)×102(图 2b);刮治合并喷砂组的 Ra=(1.2143±0.3136)×102(图2c)，各组间两两相比差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

图2 各组原子力显微镜三维重建图

2.3 不同根面处理对PDLC粘附的影响

牙周膜成纤维细胞接种于不同处理后的根片培养不同时间后，扫描电镜观察显示:1 h时3组细胞均开始附着，但均未伸展而呈圆形皱缩状(图3a、d、g)。6 h时，单纯刮治组细胞仍未完全伸展而呈皱缩状(图3b);而刮治合并激光、喷砂2组细胞则已完全伸展，且可见明显的细胞质突起(图3e、h)。12 h时，3组细胞均充分伸展，其中单纯刮治组伸展呈梭形，虽可见明显的细胞突起，但未见明显融合(图3c);而刮治合并激光、喷砂2组细胞可见大量的细胞质突起，并融合成片(图3f、i)。

图3 各组培养不同时间后扫描电镜观察(×500)

2.4 不同根面处理对PDLC增殖的影响

MTT法检测显示:牙周膜细胞在3种方法处理的根片上培养1、3、5 d后，各组细胞数量(OD值)均随培养时间而逐渐增加，其中刮治合并激光组细胞增殖最明显，刮治合并喷砂组次之。单纯Gracey刮治组最低;各时间点各组间两两相比，除1 d时激光组与喷砂组间无统计学差异(P＞0.05)外，其他各时间点3组间差异均有统计学意义(P ＜0.05)(图4)。

图4 各组培养不同时间后细胞增殖情况比较

3 讨论

研究表明，牙周炎时处于牙周袋内的患牙根面上附有龈下牙石，且可能会嵌入表层牙骨质;同时，龈下菌斑产生的内毒素也会侵入牙骨质的表层。因此，治疗牙周炎的患牙时，除了进行常规的龈上下洁治外，还要进行龈下刮治和根面平整术(subgingival scaling and root planing，SRP)，以去除嵌入牙骨质的牙石及受内毒素污染的牙骨质;并使根面平整光滑，以利于牙周膜细胞的再附着和牙周组织的愈合。

Gracey刮治器已广泛用于牙周临床治疗中，并处于不可替代的地位。但Gracey手工刮治对操作者要求较高，且费时费力，长时间操作可能引起医生的疲惫，并使之易患腕管综合征;同时在操作过程中还可能会造成患者感觉不适，术后根面敏感等情况［5］。另外，使用Gracey刮治器进行手工刮治时不仅会造成牙体硬组织表面的划痕，这种划痕很可能成为细菌再附着的巢地［6］;而且还会在根面形成玷污层［7－8］。本实验中也发现，单纯 Gracey手工刮治组的根面不仅存在较多的玷污层，并且在牙根表面造成了明显的划痕。

Nd:YAG的热效应可使蛋白凝固、变性、坏死、汽化，而具有灭菌、消毒的作用［2－3］;并且由激光产生的瞬间高温作用还可使表面牙骨质熔融，使之形成保护层而封闭牙本质小管［9］。虽然Nd:YAG激光照射并不能去除大块的牙石，因此也无法替代传统的手工刮治及根面平整;但在手工刮治后使用激光照射，可有效去除牙周袋内残存的细菌数量，并可有效去除根面残留的玷污层。本实验中扫描电镜观察发现，手工刮治合并激光照射时，其根面残留的玷污层明显少于单纯手工刮治组。而原子力显微镜观察发现，刮治合并激光组的表面粗糙程度明显高于其他两组，其原因可能是:激光的热效应可使表面附着的玷污层汽化，从而使器械造成的根面划痕更明显地暴露出来;另外，由于激光光纤的尖端细小(光纤直径0.3 mm)，只有光纤尖端与根面接触部分才能发生蒸发汽化作用，因此激光的光纤需要在根面反复移动，在移动过程中，光纤在根面各个部分的停留时间可能有所差异，从而造成了根面不同位置激光热效应作用时间不同，最终导致根面粗糙度增大。有研究认为，激光处理后的根面有利于牙周膜细胞的附着［11－12］，在本实验中也得到了同样的结果。将牙周膜细胞接种于不同方法处理后的根面进行培养时发现，1 h时3组细胞均未伸展，而呈圆形皱缩样;6 h后，单纯 Gracey刮治组细胞仍未伸展，而激光组和喷砂组细胞均已完全伸展，并可见明显的细胞突触;12 h后，单纯Gracey刮治组细胞伸展成梭形，而激光组和喷砂组细胞充分伸展并连接成片状结构。MTT法检测不同处理方式对细胞增殖的影响时发现，牙周膜细胞在3种方法处理后的根片表面培养1、3、5 d后，各组的细胞数量均随培养时间而逐渐增加，其中激光组细胞增殖最明显，喷砂组次之，Gracey组最低;各时间点各组间两两相比，除1 d时激光组与喷砂组无统计学差异(P＞0.05)外，其他各时间点各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。以上结果提示，根片虽经消毒处理后，其表面及牙本质小管内可能还残留有内毒素，从而影响细胞的增殖。而激光照射能去除根面和牙本质小管内残留的细菌及其内毒素，因此激光组更有利于牙周膜细胞的增殖。此外，本实验中龈下喷砂用的是新型喷砂材料，其主要成分甘氨酸(Glycine)具有一定的打磨能力，而不会过多破坏牙骨质表面的正常结构。有研究发现，龈下喷砂不仅可有效去除刮治后根面残留的牙石和菌斑，同时还能起到有效的抛光作用，使根面更加光滑以减少菌斑的再附着［10］。由于喷砂颗粒较小，无法去除大块的牙石，不能单独作为治疗牙周炎的方式，只能作为Gracey手工刮治的补充手段用于根面平整。

本结果显示，手工刮治结合龈下喷砂可显著降低根面的粗糙程度，并促进细胞在根面的附着;而手工刮治结合激光照射则能显著促进牙周膜细胞在牙根表面的附着和增殖。

［1］孟焕新.牙周病学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2009:208.

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