李明伟，李 鹏，陈 博，白 玉，程 庚，薛云鹏，肖 敏，余 擎

(第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科军事口腔医学国家重点实验室，陕西 西安 710032)

位于牙髓组织最外层的成牙本质细胞层是整个牙髓组织的外层屏障，其自身的完整性和连续性是牙髓组织正常发挥功能的重要前提;而成牙本质细胞层的完整性和连续性建立在完好的细胞连接基础之上。细胞连接由位于细胞之间顶部的紧密连接及其稍下方的粘附连接所构成［1－2］。组成紧密连接的蛋白主要包括occludins、claudins等跨膜蛋白和位于胞内的ZO－1(zona occludens－1)蛋白，上述蛋白可在细胞之间形成致密的环而阻止异物的侵入［2－3］。粘附连接主要由 cadherins、nectins等蛋白构成，这些蛋白可与细胞内的信号蛋白等相互作用，并最终与细胞骨架蛋白相连，从而使其能通过自身调节直接影响细胞的状态［4］。龋病作为牙体缺损的重要诱因之一，当其发展到深龋阶段而接近成牙本质细胞层时，龋损组织中的G－菌所释放的外膜毒力因子—LPS即可直接影响成牙本质细胞的生理功能，并进而影响整个牙髓组织的对外反应。

目前的研究已证实了紧密连接、粘附连接在成牙本质细胞的细胞间也有建立，并对其组成蛋白如ZO－1、claudin－1 等的表达定位进行了研究［5－6］。但是当细菌毒力因子LPS作用于成牙本质细胞时，其细胞连接的构成有怎样的改变，目前尚不清楚。有鉴于此，本研究通过观察LPS在体外条件下对成牙本质细胞细胞连接的影响，以期为相关研究奠定前期基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料试剂和设备

成牙本质细胞系(日本秋田大学Arany教授惠赠);α－MEM 培养基、胰蛋白酶(Gibco，美国);胎牛血清(FBS);PDTC(碧云天);LPS，兔抗β－actin抗体(Sigma，美国);兔抗 cadherin抗体(santa cruz，美国);Alexa Fluor 680染料标记的山羊抗兔二抗(invitrogen，美国);二氧化碳恒温孵箱(Thermo，美国);细胞总 RNA提取试剂盒(Omega，美国);反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(大连宝生生物);Real time PCR仪:ABI Prism 7500 Real－Time PCR 系统(Applied Biosystems，美国);odyssey激光成像系统(Gene Company，美国)。

1.2 成牙本质细胞的扩增培养及其形态观察

取成牙本质细胞系(odontoblast－lineage cells，OLCs)接种于含 100 mL/L胎牛血清(FBS)、2 mmol/L谷氨酰胺的α－MEM培养液中，置于含50 mL/L CO2孵箱中37℃恒温条件下进行培养。待细胞贴壁后，每隔2～3 d更换1次培养液，并用倒置显微镜观察细胞形态。

1.3 LPS对细胞连接分子mRNA表达影响的观察

1.3.1 实验分组和LPS刺激

取OLCs以5×105/孔的密度接种于6孔板，37℃、50 mL/L CO2条件下进行培养。待细胞生长融合达80%以上时，弃原培养液，并将细胞随机分为4组;分别加入含LPS终浓度为0 ng/mL(对照组)、10、100、1 000 ng/mL 的 α－MEM 培养液继续培养。

1.3.2 RT－PCR 检测

分别于上述共同培养后0、0.5、1、2 h各时间点取各组细胞，4℃ PBS冲洗两遍后，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA;并用反转录试剂盒合成cDNA(所有操作步骤均严格按产品说明)。然后使用NCBI网站的BLAST工具设计相关引物，并以cDNA为模板、β－actin作为内参，按照TAKARA实时PCR试剂盒步骤用 ABI Prism 7500 Real－Time PCR系统检测各相关细胞连接ZO－1、occludin、claudin－1以及 E－cadherin mRNA的表达水平。反应体系和条件均严格按照产品说明。所用引物由上海生工生物股份有限公司合成，各引物序列如表1所示。

表1 各引物序列

1.4 LPS与PDTC共同作用下对连接蛋白E－cadherin表达影响的观察

取OLCs以5×105/孔的密度接种于6孔板，37℃、50 mL/L CO2条件下进行培养。待细胞生长融合达80%以上时，弃原培养液，并将细胞随机分为4组，其中3组加入含LPS终浓度为10 ng/mL的α－MEM培养液继续培养，并分别于培养0、1、6 h终止培养;另一组加入含LPS 10 ng/mL、PDTC 100 μmoL/L的α－MEM培养液继续培养，并于培养后的6 h终止培养。分别取上述不同条件下培养结束后的各组细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清获得细胞总蛋白，并用BCA法测定总蛋白含量;然后取50 μg总蛋白用SDS－PAGE胶进行电泳分离。电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h后，一抗(1∶500稀释)4℃孵育过夜;二抗孵育后扫描获取图像。

1.5 统计学分析

采用SPSS 11.0软件进行统计分析，组间比较用student t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 OLCs的扩增培养及其形态

本实验所用的OLCs是一种源自牙胚的永生化细胞系，该细胞具有典型的成纤维样细胞特征，其形态呈梭型或多角形，并伴有较长的细胞突起，胞核大而圆(图1a)。细胞培养至融合后，可呈现明显的旋涡状(图1b)。

图1 OLC 的形态学观察(a.200 μm;b.400 μm)

2.2 LPS对各细胞连接分子mRNA表达水平的影响

不同浓度 LPS与 OLCs共同培养 6 h后RT －PCR检测显示，10、100、1 000 ng/mL的 LPS均可使 ZO－1、occludin、claudin－1 和 E－cadherin mRNA的表达水平降低，各浓度组(10～1 000 ng/mL)分别与对照组(0 ng/mL)相比差异均有统计学意义(P＜0.05);而各浓度组间两两相比，上述各细胞连接分子的mRNA表达水平均无统计学差异(P＞0.05)，即未呈现出明显的浓度依赖性(图2)。

然后以10 ng/mL LPS作用组为例，观察各细胞连接分子的mRNA表达水平发现:claudin－1、occludin、E－cadherin mRNA的表达水平均随作用时间的延长而逐渐降低，呈明显的时间依赖性(P＜0.05);而ZO－1 mRNA的表达水平虽也随时间而逐渐降低，但未表现出明显的时间依赖性(P＞0.05)(图3)。结果提示，LPS对细胞连接蛋白的影响是通过对其mRNA水平的调节而实现的。

2.3 LPS与 PDTC共同作用对细胞连接蛋白E－cadherin表达的影响

Western blot检测显示:单独用10 ng/mL LPS作用于OLCs时，其细胞粘附分子E－cadherin蛋白的表达随作用时间的延长而逐渐降低，表明细胞连接受到破坏;当10 ng/mL LPS与100 μmoL/L NF－κB抑制剂(PDTC)共同作用于 OLCs 6 h时，其E－cadherin蛋白的表达水平则较单独LPS作用6 h组有所提高(图4)，表明NF－κB参与了LPS对细胞连接的破坏。

图2 不同浓度LPS对各连接分子mRNA的影响

图3 LPS作用不同时间对各连接分子mRNA的影响

图4 LPS和PDTC共同作用对E－cadherin的影响

3 讨论

细胞连接作为上皮细胞之间结合的重要结构，具有阻挡异物及毒性物质入侵的作用［7］。发挥屏障作用的细胞连接结构主要是紧密连接和粘附连接。紧密连接在电镜下表现为高密度细胞融合的阻射条带，其连接的分子基础是具有四个跨膜结构域的claudins、occludins跨膜蛋白，以及位于胞内的ZO－1结构蛋白［8］。粘附连接是细胞之间较为活跃的连接结构，主要由cadherins、nectins等蛋白组成。其中ZO－1和N－cadherin在细胞粘附连接建立的初始阶段即已存在，对细胞连接的建立起着关键作用［9］。肺泡上皮细胞是肺泡内、外环境之间针对可吸入颗粒物、病毒等物质的屏障性结构，当其细胞连接被破坏时，细胞的功能则会大部分丧失从而导致肺部炎症［10］。肠上皮细胞之间的紧密连接是阻挡肠腔复合物在细胞间通过的结构性屏障，当其被破坏时则会增加异物的通透，从而造成肠黏膜的损伤［11］。当龋病发展到一定程度引起牙髓炎时，首先遭到损伤的结构是成牙本质细胞层，该层组织在炎症早期阶段可通过牙本质再生和成牙本质细胞层的重建，而形成修复性牙本质。

本实验发现，成牙本质细胞在受到LPS刺激的早期，其细胞连接蛋白的表达即开始下调;该结果提示，当G－菌侵及成牙本质细胞层时，细胞本身则会发生结构的调整和改变，包括细胞连接的改变。进一步研究发现，细胞连接蛋白表达水平的降低源于其自身mRNA水平的改变，表明由LPS引起的细胞连接的破坏主要源于细胞整体状态的改变;而且这些改变已深入到细胞核内部乃至基因转录水平。在随后的实验中还发现，当条件培养基(含10 ng/mL LPS)中同时加入 PDTC时，由于PDTC抑制了NF－κB转录因子活性，则可使LPS对细胞连接蛋白E－cadherin的抑制作用发生部分逆转;表明该过程有转录因子NF－κB的参与。综上所述，LPS作用于成牙本质细胞时激活了细胞内部的NF－κB路径，而NF－κB作为一种mRNA转录过程中的重要调节蛋白，则可通过抑制细胞连接蛋白mRNA的合成而影响细胞连接蛋白的表达水平。

有研究表明，LPS不仅能通过位于细胞膜表面的TLR4受体直接激活胞内的NF－κB路径，从而引起下游相关分子的改变［12－13］。同时还能通过与细胞作用，而引起细胞炎性介质(如TNF－α、IL－1β)的释放［14－16］;而 TNF－α 和 IL－1β 又可通过自身位于细胞膜表面的受体而激活胞内的NF－κB信号路径［17－19］。但是，当 LPS作用于成牙本质细胞时，其激活NF－κB路径的方式是直接激活还是间接激活，或者是两者的共同作用，还需进一步的实验证实。

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