任 蕾，冯海燕，杨晓辉，雷 霓

（石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035）

分光光度法测定柿蒂中总三萜酸的含量

任 蕾，冯海燕，杨晓辉，雷 霓

（石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035）

测定中药柿蒂中总三萜酸的含量，以药材中指标性成分熊果酸为对照品，采用5%香草醛-冰醋酸、高氯酸显色后，分光光度法测定柿蒂提取液中总三萜酸的含量.结果显示：三萜酸含量在2.32-16.24 μg/mL范围内呈良好线性关系，其回归方程为：A=0.056 7C+0.000 286，r=0.998 5.柿蒂中总三萜酸含量为5.93%，加样回收率平均为103.09%.该法操作简便，重现性好，结果可靠，可用于柿蒂药材中三萜酸成分的质量控制.

柿蒂；三萜酸；含量测定；分光光度法

柿蒂（Kaki calyx）是柿树科植物柿的干燥宿萼，主产于河北、河南、山东、福建等地，是一种传统中药.其味苦、性温，有降气、止呃之功能，常用于胃寒气滞的呃逆[1].除此以外，柿蒂提取物还有镇静、抗心率失常和一定的抗生育作用[2].研究表明三萜酸类化合物为柿蒂主要活性成分，但其测定方法未见国内外报道.笔者采用分光光度法对柿蒂中总三萜酸的含量进行了测定，旨在为柿蒂的应用研究提供理论依据，也可用于柿蒂及相关产品的质量控制.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV/VIS-916紫外分光光度计（澳大利亚GBC科学器材有限公司）；YJ501型超级恒温器（上海跃进医疗器械厂）；KQ-250DE医用数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省巩义市予华仪器有限责任公司）；FA2204B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）.

1.2 试剂与材料

熊果酸（批号：110742-200518，中国药品生物制品检定所）；纤维素酶（批号：F20101015，国药集团化学试剂公司）；无水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛、甲醇、乙酸乙酯等均为分析纯，实验用水为石英高纯水.柿蒂购于安国东方药城中药材有限公司.

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

对照品溶液：准确称取熊果酸5.8 mg，置于25 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解定容至刻度，得0.232 mg/mL对照品溶液.

供试品溶液：取柿蒂粉末，参照文献[3]的条件用石油醚（60-90℃）脱色，再按以下3种方法分别对柿蒂总三萜酸进行提取：

热回流法 精确称取2 g柿蒂，加入60%乙醇溶液50 mL，于80℃恒温水浴锅中回流提取2.5 h.减压过滤，滤液定容至100 mL，得样品Ⅰ.

超声波法 精确称取2 g柿蒂，加入70%乙醇溶液60 mL，在60℃的温度下超声萃取40 min.其它操作同热回流法，得样品Ⅱ.

酶辅助提取法 精确称取2 g柿蒂，加入pH5.0 HAc-NaAc缓冲溶液18 mL和6 mg纤维素酶，置于45℃恒温水浴锅中酶解2h.酶解结束后沸水浴灭活3min，加入42mL无水乙醇，在60℃的条件下超声提取40min.其它操作同热回流法，得样品Ⅲ.

2.2 测定波长的选择

分别移取对照品溶液0.2 mL，Ⅰ-Ⅲ供试品溶液0.1 mL于10 mL量瓶中，沸水浴挥干溶剂，各加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸1.0 mL，混匀，密塞，其余同标准曲线项下操作，在200-700 nm进行波长扫描.结果表明，对照品和供试品溶液吸收变化趋势基本相符，且在 550 nm处均有明显吸收，故选择测定波长为550 nm.

2.3 显色条件的选择

香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法[3-6]是测定三萜酸类化合物常用方法，但其影响因素较多，试剂的用量、反应的温度以及反应时间等因素影响较为显著.实验中考察了5%香草醛-冰醋酸用量 （0.1-0.5 mL）、高氯酸用量（0.6-1.4 mL）、水浴温度（40-80℃）及显色时间（5-25 min）对实验的影响，确定了最佳的显色条件为：加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸1.2 mL，混匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热15min.在此前提下，针对文献报道中定容溶剂不统一的现象[3-6]，还考察了定容溶剂对显色体系的影响，结果如图1所示.5种研究溶剂中，甲醇定容时体系的吸光度最小，仅为0.03；冰醋酸与乙酸乙酯定容时，吸光度最高.考虑到冰醋酸价格比较便宜，试验选择冰醋酸作定容溶剂.

2.4 线性关系考察

图1 定容溶剂对吸光度的影响

图2 标准曲线图

精密吸取熊果酸对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，分别置于10mL量瓶中，沸水浴挥干，各加0.2 mL新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液，1.2 mL高氯酸，混匀，密塞，在60℃水浴中反应15 min后，取出，于流水冷却3 min，加冰醋酸定容.以相应试剂为空白，在550 nm波长处测吸光度（A）.以A A为纵坐标，熊果酸质量浓度（C）为横坐标，绘制工作曲线（图2）.工作曲线方程为A=0.056 7C+0.000 286，r=0.998 5，在2.32-16.24 μg/ml浓度内线性关系良好.

2.5 精密度试验

分别精密吸取0.1 mL，Ⅰ-Ⅲ供试品溶液各5份，按2.4项下操作，测定其吸光度.结果表明，吸光度RSD分别为0.73%，1.25%和1.51%.

2.6 稳定性试验

精密吸取对照品溶液0.2 mL及Ⅰ-Ⅲ供试品溶液各0.1 mL，分别按2.4项下操作，在0-60 min内每隔5 min测定吸光度.结果在40 min以内，吸光度变化较小，RSD分别为0.75%，1.21%，1.87%，0.52%；随时间延长，吸光度逐渐减小，60 min时对照品吸光度的RSD为0.88%，而3份供试品溶液吸光度的RSD均大于3.0%.表明供试品溶液应在40 min以内测定，而对照品则较稳定，故选择在显色后40 min之内测其吸光度.

2.7 重现性试验

按2.1项下热回流法、超声波法和酶提取法分别制备供试品溶液，每种方法平行制备5份.精密吸取供试品溶液 0.1 mL，按2.4项下测定吸光度，计算总三萜酸的质量分数，3种提取方法的RSD分别为2.16%，0.37%和1.89%.

2.8 回收率试验

精密吸取Ⅰ-Ⅲ供试品溶液各0.05 mL，分别加入与样品中总三萜酸含量相当的熊果酸对照品溶液0.25，0.20，0.20 mL，依法测定，计算回收率.结果平均回收率分别为 103.09%（RSD为1.06%），107.54%（RSD为1.32%），104.18%（RSD为2.70%）（n=6）.

2.9 样品的测定

取Ⅰ-Ⅲ 供试品溶液，测定吸光度，按回归方程计算总三萜酸含量，结果见表1.

表1 柿蒂总三萜酸含量测定结果（n＝5）

3 讨论

1）本试验以柿蒂主要三萜酸成分熊果酸为对照品，建立了比色法测定柿蒂总三萜酸含量的方法.该法简便可靠，可作为柿蒂质量控制的依据.

2）文献报道主要考察5%香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、水浴温度及加热时间对显色的影响.本实验发现，定容溶剂对熊果酸显色体系吸光度的大小也有显著影响，冰醋酸和乙酸乙酯是合适的定容溶剂.

3）试验比较了热回流提取、超声波提取和酶法辅助提取3种不同提取方法，具体的提取条件为L9（43）正交实验的结果.结果表明：热回流提取法最好，提取量最高，耗时与酶法辅助提取相当；超声提取法虽简单省时，但提取率较低，提取不完全.因此，热回流法是提取柿蒂总三萜酸的有效方法.

4）样品测定的结果可知，柿蒂富含三萜酸，含量高达5.93%，相比柿叶[3]具有更大的药用开发价值和潜力. 5）香草醛放置过程中易被氧化，因此5%香草醛-冰醋酸临用前要新鲜配制，以减小实验误差.

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：233.

[2]熊海涛，唐志华，郑行望.火焰原子吸收光谱法测定柿蒂中微量元素[J].理化检验（化学分册），2010，46（10）：1 211-1 212.

[3]范杰平，何潮洪，傅鹏飞.柿叶中总三萜的提取以及熊果酸分离、纯化研究[J].中国药学杂志，2007，42（16）：1 258-1 261.

[4]季春，张融，胡晨，等.比色法测定南蛇藤中总三萜类成分的含量[J].时珍国医国药，2009，20（4）：909-910.

[5]马荣，刘岱琳，殷军.比色法测定固公果根中三萜类成分的含量[J].武警医学院学报，2010，19（2）：114-116.

[6]蔡亚玲，阮金兰，苏群，等.紫背鼠尾草中总三萜酸的含量测定[J].中药材，2008，31（5）：692-693.

（责任编辑 李健飞）

Determination of the Content of Triterpenoidic Acid in Kaki Calyx

REN Lei，FENG Hai-yan，YANG Xiao-hui，LEI Ni
（School of Chemical Engineering，Shijiazhuang University，Shijiazhuang，Hebei 050035，China）

The content of triterpenoidic acid in Kaki calyx is determined.With ursolic acid as the reference，5% vanillin-acetic acid and perchloric acid as the developer，the spectrophotometric method is used for determining the triterpenoidic acid in Kaki calyx.Results show that the calibration curve is linear（r=0.9985）in the range of 2.32~ 16.24 μg/mL，and that the regression equation is A=0.0567C+0.000286.The content of triterpenoidic acid in Kaki calyx is about 5.93%and the average recovery is 103.09%.Therefore，the method is simple，accurate and reproducible，and it could be used for monitoring the quality of triterpenoidic acid in Kaki calyx.

Kaki calyx；Triterpenoidic acid；content determination

R284.1

：A

：1673-1972（2014）06-0028-03

2014-07-23

石家庄学院自然科学研究启动基金（12YB011）

任蕾(1980-)，女，河北石家庄人，讲师，主要从事天然食品抗氧化剂及其应用研究.