李国清等

摘 要 为了明确中国桉树焦枯病病原菌的物种多样性、生物学特性和致病力强弱，本试验对在中国报道的桉树焦枯病病原菌进行了形态学比较，β-tubulin、Histone H3、TEF-1α三段基因系统发育学分析，并测定各病原菌在7个温度下的菌落生长速度，以及对4个桉树无性系（DH32-29、广州1号、广林4号、OC14）离体叶片的致病力大小。结果表明，到目前为止我国桉树焦枯病病原菌分属6个不同的物种，分别是Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. pauciramosa、Ca. pseudocolhounii、Ca. pseudoreteaudii和Ca. fujianensis。不同病原菌的形态存在一定差异，病原菌分属于不同的系统发育树分枝。被测试病原菌的最适生长温度为20～30 ℃，在5 ℃和35 ℃下均停止生长。被测试的5种桉树焦枯病病原菌在4个桉树无性系上的致病力差异显著，总体致病力强弱顺序为：Ca. cerciana > Ca. pauciramosa > Ca. pseudoreteaudii > Ca. crousiana > Ca. fujianensis。桉树无性系对不同种桉树焦枯病病原菌的抗性存在显著差异。研究结果显示桉树焦枯病病原菌物种存在多样性，各病原菌的致病性差异显著，有针对性地选择抗特定病原物种的桉树无性系是解决桉树焦枯病危害的一条有效途径。

关键词 丽赤壳属；帚梗柱孢属；桉树人工林；接种；叶焦枯

中图分类号 S432 文献标识码 A

Preliminary Analyses on Diversity and Pathogenicity of

Calonectria spp. on Eucalyptus in China

LI Guoqing1， CHEN Shuaifei1 *， WU Zhihua1， ZHOU Xudong2， XIE Yaojian1

1 China Eucalypt Research Centre， Zhanjiang，Guangdong 524022， China

2 Futura Gene Biotechnology， Xuhui， Shanghai 200235， China

Abstract Calonectria leaf blight caused by Calonectria spp. is a serious disease on Eucalyptus trees in the world. The aims of the study were to clarify the species diversity and pathogenicity of Calonectria spp. on Eucalyptus trees in China. Species diversity of Calonectria were clarified based on comparisons of DNA sequences data of ITS， Histone H3， and TEF-1α gene regions， and combined with the fungal morphological characteristics and culture growth features. Research results indicated that six species of Calonectria were existed， these species included Ca. cerciana， Ca. crousiana， Ca. pauciramosa， Ca. pseudocolhounii， Ca. pseudoreteaudii and Ca. fujianensis. Six species could be distinguished by morphological characteristics. The six species resided in different phylogenetic groups. The culture growth features are different for the tested five Calonectria spp. The optimal growth temperature for Calonectria spp. is 25-30 ℃， no growth at 5 ℃ or 35 ℃. Leaf inoculations showed that all four Eucalyptus clones（Guang 1， Guang 4， DH32-29， OC14）tested were susceptible to infect by five tested Calonectria spp. Significant differences of virulence were observed among five Calonectria spp.， with rank of Ca. cerciana > Ca. pauciramosa > Ca. pseudoreteaudii > Ca. crousiana > Ca. fujianensis. Significant differences of resistances were observed among four tested Eucalyptus clones. The paper revealed that species diversity of Calonectria on Eucalyptus trees in China， and provided prospects to select disease-tolerant planting stock for the disease management of Calonectria leaf blight on Eucalyptus trees in the future.

Key words Calonectria； Cylindrocladium； Eucalyptus plantations； Inoculations； Leaf blight

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.025

桉树（Eucalyptus spp.）作为世界公认的三大速生树种之一，在我国已成为南方发展速生丰产林的战略性树种[1]。近10年来，我国桉树人工林面积已由154万hm2（2000年）上升到了368万hm2（2010年），桉树给我国带来了巨大的经济、生态和社会效益[2-3]。但是，随着我国桉树纯林面积的增加，桉树人工林受病虫害的威胁也越来越大，人工林的不稳定性也急剧增强[3]。

桉树焦枯病是一种由Calonectria（Ca.）属真菌引起的世界性重大病害，严重影响桉树的健康生长[4-12]。其病原隶属于子囊菌门（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），丛赤壳科（Nectriaceae），丽赤壳属（Calonectria）；无性阶段属帚梗柱孢属（Cylindrocladium）[2，10-12]。对于桉树焦枯病病原菌的命名，一直以来采用双拉丁学名（有性属名Calonectria，无性属名Cylindrocladium），根据近来国际真菌命名的共识：“一种真菌，一个名称”原则[13-15]，Lombard等[12，16]对Calonectria属真菌进行了分子、形态以及生物学的系统研究，选择1867年建立的有性属名Calonectria代替1892年建立的无性属名Cylindrocladium来统一表述此属真菌。本研究也采用这一观点。

据报道，桉树焦枯病病原广泛的分布于我国广西、广东、海南、福建等省份的桉树人工林[6，17-23]。目前在我国广东、福建已报道的桉树焦枯病病原菌有6种，其中在广东发现的有Ca. cerciana、Ca. pauciramosa、Ca. pseudoreteaudii，在福建发现的有Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca. pauciramosa、Ca. pseudocolhounii[6，23]。

桉树焦枯病给我国桉树人工林的健康可持续发展带来一定威胁[5，24，25]，在1996年桉树焦枯病就已被列入到国内森林植物检疫对象。据估计，仅我国福建省平均每年由于桉树焦枯病造成的损失就达0.518亿元[24]，对桉树焦枯病防控的研究需要加强。选育抗病桉树无性系是焦枯病防控的最有效措施之一，陈帅飞等[6]的研究结果表明不同桉树无性系对同一种焦枯病原菌抗性存在显著差异。在明确桉树焦枯病病原物种多样性的基础上测试病原菌的致病性对抗病桉树无性系的选育具有重要意义，而相关研究在我国十分有限。本研究主要通过分子生物学方法及形态学方法结合病原的生物学特性对我国桉树焦枯病不同病原菌进行比较分析，讨论病原的物种多样性，并对不同桉树无性系进行不同病原菌的致病力测试，以期为桉树焦枯病病原菌研究及病害防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

桉树焦枯病病原菌包括到目前为止在我国桉树上发现和鉴定的所有6个Calonectria种，菌株包括各个Calonectria种的正模标本菌株，菌株来自于国家林业局桉树研究开发中心（China Eucalypt Research Centre）森林健康课题组菌种保藏库（CERC）和南非比勒陀利亚大学-林农生物技术研究所（Forestry and Agricultural Biotechnology Institute）菌种保藏中心（CMW）（表1）。

桉树组培苗DH32-29（E. urophylla × E. grandis）、广州1号（E. urophylla × E. tereticornis）由南方国家级林木种苗示范基地提供，广林4号（E. urophylla×E. grandis）、OC14（父母本未明）由广西斯道拉恩索林业有限公司提供。桉树苗高40 cm左右，长势健壮，无病虫害。

2% MEA培养基（20 g麦芽粉，20 g琼脂，1 L水）。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌形态学分析 通过查阅中外文献，并结合Lombard等[23]和陈帅飞等[6]的研究结果，综合比较分析我国桉树焦枯病病原菌结构和形态特征。比较分析的对象包括各Calonectria种的有性阶段和无性阶段的微观结构，主要包括子囊类型、囊泡形状、有性孢子和无性孢子的大小等典型特征。

1.2.2 病原菌系统发育学分析 本研究选用34株桉树焦枯病病原菌（表1），从GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）上下载供试菌株的3对基因序列β-微管蛋白（β-tubulin）、组蛋白H3（Histone H3）及翻译延伸因子TEF-1α（translation elongation factor-1α），用BioEdit和Mega4.0进行序列拼接并手动调整，用PAUP4.01软件以Ca. colombiensis为外群构建ML（Maximum likelihood，最大似然法）系统发育树，其中Bootstrap检验的重复次数为1 000次。

1.2.3 菌落生长速度测定 将25 ℃下MEA平板上培养一周的病原菌用5 mm打孔器取菌饼（含菌落的培养基）正面朝下转接于2% MEA平板上，设置5、10、15、20、25、30、35 ℃ 7个温度梯度，每个病原菌转接3个平板。相同条件下培养7 d，采用十字交叉法测量菌落直径；为保证试验的可靠性，整个试验在相同条件下重复1次。

1.2.4 致病力测试 试验采用Ca. cerciana（CMW25290，CMW25309）、Ca. crousiana（CMW27249，CMW27253）、Ca. fujianensis（CMW27254，CMW27257）、Ca. pauciramosa（CMW25283，CMW25311，CMW27199，CMW27203）和Ca. pseudoreteaudii（CMW25292，CMW25310）5种致病菌共12株菌对4个桉树无性系（DH32-29、广州1号、广林4号、OC14）进行致病力测定。

（1）病菌培养。将病原菌转接至2% MEA培养基上，室温培养1周待用；

（2）离体叶片的采集。4个桉树无性系组培苗放置于阴棚中1个月，使之保持健康生长。采集的叶片用5%的漂白水表面消毒3 min，清水冲洗3次，然后背面朝上平放于底部有少许清水的保鲜盒隔离垫上；

（3）接种方法。用5 mm打孔器取病原菌菌饼，菌丝朝下放置于叶片上，然后喷洒少许清水使菌饼与叶片充分接触。每株菌接种5片叶子，以无菌的5 mm 2% MEA培养基菌饼作为负对照；

（4）保持室内温度30 ℃、湿度70%，处理4 d后测量并记录病斑长度；

（5）为保证试验的可靠性，整个试验在相同条件下重复1次。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0、SAS 9.3、Excel进行方差分析和数据处理。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学分析

在我国发现的6种桉树焦枯病病原菌形态特征比较详见表2。从表2可以看出，6个桉树焦枯病病原物种之间的形态存在明显差异。如：Ca. cerciana（囊泡纺锤形或倒梨形）和Ca. pauciramosa（囊泡椭圆形）可以通过囊泡的形状与其他4个种（Ca. crousiana，Ca. fujianensis，Ca. pseudocolhounii，Ca. pseudoreteaudii：囊泡棍棒状）区分开来。6个种的分生孢子也存在一定的差异，如Ca. cerciana的大分生孢子（av.=44 μm × 4 μm）最小，而Ca. pseudoreteaudii的大分生孢子（av.=104 μm × 8 μm）最大，两者大分生孢子长度相差60 μm。而对于在无性阶段中非常相似的Ca. crousiana（子囊8-孢子）和Ca. pseudocolhounii（子囊4-孢子），它们的子囊类型差异很大。

2.2 病原菌系统发育学分析

34株桉树焦枯病病原菌的三段基因序列拼接后构建的ML系统发育树见图1。由图1可以看出，6种病原菌分别聚为4个组，Ca. pauciramosa和Ca. cerciana被归类到Ca. pauciramosa物种组合体中，支持率（Bootstrap value）为97%，Ca. pseudocolhounii和Ca. fujianensis被归类到Ca. colhounii物种组合体中，支持率为100%；Ca. pseudoreteaudii被归类到Ca. reteaudii物种组合体中，支持率为100%；Ca. crousiana独立于其他组合体之外，支持率为100%。其中，Ca. pseudoreteaudii与Ca. reteaudii亲缘关系密切，其支持率为58%，其余5种病原菌被聚为单分支的支持率均在93%～100%之间。

2.3 不同温度对菌落生长的影响

7个温度梯度下桉树焦枯病病原菌菌落直径差异见表3。结果表明，桉树焦枯病病原菌的生长温度范围为10～30 ℃，最适宜生长的温度范围为20～30 ℃，10 ℃、15 ℃下生长明显受到抑制，5 ℃和35 ℃下均停止生长；不同温度下5种病原菌的生长速度存在差异（表3）。

对各菌株在各温度下的所有处理进行SAS单因素方差分析可知，同种病原菌在不同温度条件下生长速度差异显著，不同种病原菌在同一温度下的生长速度也存在差异（表3）。不同种病原菌的最适生长温度也有所差异（除Ca. pseudoreteadii为30 ℃外，其余均为25 ℃）。在最适生长温度下，Ca. cerciana的生长最快，Ca. pseudoreteaudii最慢。通过SPSS双因素（菌株和温度）方差建模分析（调整后的决定系数R2=0.938）可知，菌株和温度各自对菌落直径大小的影响显著（p<0.001），菌株和温度之间的交互作用显著（p<0.001）。

2.4 致病力测定

致病力测定结果显示，在接种24 h后，部分桉树无性系叶片上开始产生病斑；4 d后，4个无性系均产生病斑，对照无病斑。5种桉树焦枯病病原菌对4个桉树无性系的致病力结果以及各菌株在各无性系上的所有处理进行SPSS单因素方差分析结果见表4。

在无性系OC14上，CMW25309[Ca. cerciana，（5.70±0.17）cm]病斑平均长度最大，CMW27254（Ca. fujianensis）、CMW27257（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）与对照组相比差异不显著；在广4上，CMW25309[Ca. cerciana，（5.23±0.15）cm]病斑平均长度最大，CMW27254（Ca. fujianensis）、CMW27257（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）与对照组相比差异不显著；在广1上，CMW25309[Ca. cerciana，（3.72±0.11）cm]病斑平均长度最大，CMW27253（Ca. crousiana）、（Ca. fujianensis）、CMW27257（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）、CMW27199（Ca. pauciramosa）与对照组相比差异不显著；在DH32-29上，CMW25311[Ca. pauciramosa，（4.93±0.27）cm]病斑平均长度最大，CMW27254（Ca. fujianensis）、CMW25283（Ca. pauciramosa）与对照组相比差异不显著（表4）。

5种桉树焦枯病病原菌在4个桉树无性系均能产生病斑，Ca. cerciana、Ca. pauciramosa、Ca. pseudoreteaudii、Ca. crousiana产生病斑的长度均与对照组存在显著性差异，而Ca. fujianensis与对照组差异不显著；除Ca. cerciana在4个无性系上产生病斑长度有显著差异外，其余4种病原菌在4个无性系上产生的病斑长度无显著差异（表4，图2）。

综合5种致病菌在4个桉树无性系上产生病斑的大小，表明5种Calonectria spp. 致病菌的致病性强弱顺序是：Ca. cerciana > Ca. pseudoreteaudii > Ca. pauciramosa > Ca. crousiana > Ca. fujianensis，其中Ca. fujianensis与对照组差异不显著（表4，图3）。

综合分析本试验4个桉树无性系对5种桉树焦枯病致病菌的抗性，广1抗性显著强于其余3个无性系（表4，图4）。

通过SPSS双因素（菌株和无性系）方差建模分析可知（调整后的决定系数R2=0.854），菌株和无性系各自对病斑长度的影响显著（p<0.001），菌株和无性系的交互作用显著（p<0.001）。

3 讨论与结论

本研究通过对我国不同桉树焦枯病病原菌的形态学比较，基于多基因片断的系统发育分析，结合病原菌在不同温度下的生长特征证明了我国桉树焦枯病病原物种的多样性。致病力测试试验结果表明不同桉树焦枯病病原物种对同一桉树无性系的致病性存在显著差异，不同桉树无性系对同一病原菌的抗病性的差异。

真菌形态特征是了解病原真菌的最直观途径，是病原真菌鉴定分类的关键手段。本研究结果表明：在我国发现的6个不同种的丽赤壳属真菌，它们子囊的颜色和结构、囊泡的形状、有性和无性孢子的大小存在一定差异。真菌形态结构易受到外界环境条件的影响。现阶段分子生物学的兴起为病原菌的鉴定分类提供了可靠保障。近年来，借助多基因序列的分子系统发育分析，辅助形态学比较分析为林木真菌的鉴定分类提供了一条可行且比较客观的途径。运用此方法，Lombard等[16]和陈帅飞等[6]把桉树焦枯病致病菌所属的丽赤壳属真菌归类为71个种。因此，未来基于多基因序列的分子系统发育分析结合形态学比较分析将在丽赤壳属真菌以及其他林木病原真菌的鉴定分类上继续发挥重要作用。

温度的高低影响到桉树焦枯病菌的生长和对桉树的侵染。研究不同温度对病原菌生长的影响能帮助预测病害发生和流行的时间。陈英[25]对1种桉树焦枯病病原菌（Ca. reteaudii）研究结果表明，病原菌的最适生长温度为25 ℃，10 ℃、40 ℃下停止生长，这与本研究结果部分内容一致，但是本研究对5种病原菌菌丝生长温度发现，10 ℃下部分病原菌停止生长，但是部分病原菌仍能生长，35 ℃下均停止生长。本研究结果表明：在桉树焦枯病病原菌的最适宜生长温度范围内，须对焦枯病的发生和流行提高警惕，并采取防范措施。在低温下焦枯病菌生长明显受到抑制，但是Ca. cerciana、Ca. pauciramosa、Ca. crousiana、Ca. fujianensis仍能致病，这表明焦枯病菌具有很强的温度适应性，这可能是桉树焦枯病病原菌破坏性比较大的原因之一。

陈全助[26]通过桉树焦枯病发病程度的野外调查发现，不同的桉树种系对桉树焦枯病的抗病能力有一定差异，陈帅飞等[6]对不同种桉树焦枯病病原菌致病力试验结果表明，不同病原菌对不同桉树无性系的致病力存在差异，这与本研究结果一致。

对桉树焦枯病病原菌进行准确鉴定分类是研究桉树焦枯病致病机理以及防控桉树焦枯病的基础。本研究证明不同桉树焦枯病菌的生物学特性、致病性等均有不同，因此不能笼统的把它们作为一个物种来研究。桉树焦枯病病原的物种多样性比较高[6，23，27]，在我国仅广东、福建两省就已发现6种病原[6，23]，由于我国各个省份的气候、桉树品系等存在一定差异，在其他桉树焦枯病严重发病的区域，焦枯病原菌可能存在物种多样性。有针对性的选择抗病的桉树无性系是防控桉树焦枯病的一条有效途径。本试验结果表明：5种病原菌在离体叶片上均能造成病斑，对4种桉树无性系的致病力差异明显，因此，有必要对我国桉树主要种植区域进行广泛的调查采样，进行桉树焦枯病病原的鉴定分类以及病原菌的分布研究，掌握不同区域的优势病原菌，进而在不同区域通过病原菌在不同桉树无性系上的致病力测试来选育抗病桉树品系，这对桉树焦枯病的综合防控具有重大意义。

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责任编辑：沈德发