杨茹薇+冯怀章+孙慧+徐琳黎+李江涛

摘要：为有效而快速评价不同马铃薯品种对马铃薯早疫病的抗性水平，选取D5、D19、D30、A1、B1、C3的6个马铃薯品种的脱毒试管苗和马铃薯早疫病菌为试验材料，将脱毒试管苗接种马铃薯早疫病菌，调查其生长情况。结果表明，脱毒试管苗接种适当浓度的早疫病孢子囊悬浊液，可判断不同品种的马铃薯试管苗的抗性，其中，B1品种抗病性表现最强。使用孢子悬浊液接种马铃薯脱毒试管苗是可行的，可用于对抗性资源的早期评价。

关键词：马铃薯早疫病；接种；马铃薯脱毒试管苗；抗性鉴定

中图分类号：S532；S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2674-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.018

Abstract： For the effective and rapid evaluation the potato varieties of early blight resistance level， selecting D5，D19，D30，A1，B1，C3 six varieties of virus-free potatos tube plantlets and potato early blight fungus as experimental material， the virus-free tube plantlets inoculated potato early blight fungus， and investigated its growth. The results showed that the virus-free potato tube plantlets inoculation of the appropriate concentration of early blight sporangium suspension， which could diagnose the resistance of different varieties of potato tube seedlings， and B1 breed showed the strongest disease resistance. The use of virus-free potato tube plantlets inoculated with spore suspension was feasible， which could be used for early evaluation of antagonistic resources.

Key words： potato early blight； inoculate； virus-free potato tube plantlets； resistance identification

馬铃薯是茄科茄属的一年生草本块茎植物，是重要的粮食、蔬菜兼用作物。马铃薯早疫病由茄链格孢（Alternaria dauci）侵染引起，是马铃薯生产中严重的病害，在马铃薯各产区均有发生，并有逐年加重的趋势[1，2]。尤其在发展中国家被认为是仅次于马铃薯晚疫病的第二大马铃薯病害[3]。生产上对马铃薯晚疫病、病毒病的抗病性评价较多[4，5]，而对早疫病研究较少[6，7]。选用抗病品种是防治马铃薯早疫病最经济、最有效的措施，而对马铃薯品种抗病性的评价可为马铃薯品种种植的合理布局提供可靠依据[8]。

通过不同品种脱毒试管苗接种早疫病菌的观察总结，本试验拟初步建立马铃薯抗早疫病试管苗评价体系，成为最经济有效且能快速应用于生产实践的手段，并选育出适合新疆栽培的抗早疫病马铃薯品种。

1 材料与方法

1.1 材料

选用D5、D19、D30、A1、B1、C3的马铃薯脱毒试管苗为接种材料，以接无菌水的材料为对照。

1.2 标本采集

2016年7月，在新疆主产区采集马铃薯不同栽培品种的早疫病病样，将采集到的植株装于密封袋中，做好标记并放入冰盒中，回到实验室后立即将植物样品放入4 ℃冷藏冰箱中低温保存，以确保样品中早疫病菌的活性。

1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖10 g，琼脂17 g，去离子水1 000 mL。每瓶所含培养基体积均为40 mL[9]。

1.4 病原菌的分离、纯化与鉴定

将具有典型症状的病叶经自来水冲洗，洗去病叶表面污物、孢子囊、菌丝等，置于75%乙醇中浸泡30 s，然后放入0.1%升汞中浸泡30 s，再用灭菌水冲洗3遍[10]，放在干净的滤纸上吸去水。用灭菌刀除去严重的部分，取病健交界的叶片，将其背面朝上置于经高压灭菌的PDA平板上，每皿3～4块，后置于25 ℃培养箱中黑暗培养2～3 d，当菌落直径长到1～2 cm时，镜检各菌落，确认目标菌落。在无菌操作中，从目标菌落的边缘挑取一小块带有菌丝的培养基再移接于PDA培养基进行纯化，直至菌落生长整齐一致无杂菌出现为止[11]。

分离出的菌株进行统一编号，编号包含样本采集地点和分离顺序等。对分离得到的菌株，在PDA培养基上18 ℃培养，观察并记录各菌株的菌落形状、色泽和生长速度；在显微镜下观测菌丝的形态，并观察是否具有孢子囊及其形态、大小，并照相。参考魏景超[12]的鉴定方法，对所得菌株进行形态学鉴定，最终得到试验所需菌株。

本试验共分离获得28株马铃薯早疫病菌，采集地点和菌株编号见表1。

1.5 致病性测定

1.5.1 孢子囊悬浊液准备 在实验室无菌条件下，将采集纯化后的菌种移至PDA平板培养基上常温保存，在光照下培养14 d生成孢子囊，在无菌条件下向平板上注入无菌水后过滤，收集孢子囊悬浊液，镜检并稀释到6个孢子囊/100倍视野，备用。

1.5.2 接种方法 待试管苗长至7～8叶时，在无菌环境下用移液枪吸取10 μL接种至试管苗根茎约5 cm处注入（不接触底部培养基），每个品种接种10株，以接无菌水作对照，温度保持在25 ℃。

1.5.3 调查分级标准 接种后每天调查1次疫病发生情况，计算病情指数和发病率，并记载病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯等，分级标准参照文献[13]。

采用茎部病情分级及反应型划分标准。0级，无任何症状；1级，幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级，幼苗根茎部变黑达1～2 cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级，幼苗根茎部变黑超过1～2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级，幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；5级，植株枯死。

病情指数（DI）=[∑（病级数×该病级植株数）×100]/（病级最高值×调查株数）

病情指数与抗病性的关系：免疫（I），DI=0；高抗（HR），050。

2 结果与分析

2.1 抗病性测定

接种后各品种对早疫病的抗性结果见表2。由表2可知，脱毒马铃薯试管苗在接种后2 d开始发病，发病较轻的是A1和B1，3 d发病率分别为20%和10%，而D5、D19、D30、C3的发病率分别为40%、60%、50%、50%。接种后6 d，D5和B1的病情指数分别为37和20，而D19、D30、A1、C3的病情指数分别为50、63、45、47；B1的发病率最低，为20%，D19的发病率最高，为90%。接种后9 d，D19、A1、B1病情指数分别为45、43、20，而D5、D30、C3病情指数均高于50，分别为73、53、57。接种后12 d，除B1外其余品种发病指数高于50且发病率均为100%。

2.2 接种后的发病情况

接种后2 d发现各品种对马铃薯早疫病的抗性不同。由于接种采用无伤口且不接触培养基操作，接种后2 d在接种点出现毛状物，并且向周围扩展，由于茎部细胞逐渐解体，限制了水分的流动传递，造成植株萎蔫，直至死亡。所有接种无菌水的对照在接种点无任何变化，试管苗生长正常。各马铃薯品种对早疫病的抗病性见表3。由表3可知，接种后5 d，D5、D19、A1、C3表现为中抗（MR），D30表现为感病（S），B1表现为抗病（R）。接种后10 d，D19、A1表现为中抗（MR），D5、D30、C3表现为感病（S），B1表现为抗病（R）。接种后15 d除B1表现为中抗（MR）外，其余品种均表现为感病（S）。由此可见，B1明显优于其他品种，具有较强的抗性。

3 讨论

本试验采用不同品种的脱毒试管苗作为试验材料，人工接种孢子悬浊液直接侵染瓶内试管苗，可观测试管苗的感病情况，能排除田间环境干扰因素，缩短鉴定周期。试管苗接种法变量单一、反映更加直观，能快速有效地进行生长及发病后症状观察，为生产上选用抗病品种提供了依据，初步建立马铃薯试管苗抗早疫病评价体系，成为最经济有效且能快速应用于生产实践的方法。

根据观察结果发现品种间抗病性存在明显差异，接种浓度选用6个孢子囊/100倍视野，接种试管苗龄选择在7～8叶期，接种后10 d调查并统计病情指数，即可准确判断供试品种的抗病性情况。接种早疫病菌后的试管苗一般叶部先发病，逐渐侵染至茎部，导致叶片萎蔫脱落。由此可以判断是病原菌产生的分泌物毒性，致使植株感病萎蔫死亡。关于病原菌分泌物如何作用于植株，还有待进一步的探索。

参考文献：

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[3] 刘 洋，蒋继志，杨发茂，等.几种化学物质诱导马铃薯对早疫病的抗性及其机理研究[J].华北农学报，2006，21（2）：113-117.

[4] 王晓明，金黎平，尹 江.马铃薯抗病毒病育种研究进展[J].中国马铃薯，2005，19（5）：285-289.

[5] 全洪友，卫双荣，莫荣富.马铃薯新品种引种试验研究[J].现代农业科技，2009（15）：109，113.

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[10] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.

[11] 张福光.河北省早疫病菌群体结构研究及马铃薯栽培品种对早疫病的抗性评价[D].河北保定：河北农业大学，2011.

[12] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[13] 易图永，张宝玺，谢丙炎，等.辣椒疫病三种接种方法的比较[J].中国蔬菜，2003（2）：16-18.