李博勋等

摘 要 前期利用cDNA-AFLP技术分离获得了一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的差异表达基因片段EST-IAN-188，通过Blast比对分析发现，该基因片段与植物抗病相关NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性。将该片段与橡胶树基因组序列进行比对，设计引物进行PCR扩增，得到了一个橡胶树NPR1基因的cDNA和基因组序列，命名为HbNPR1基因。基因序列分析显示，该基因编码区全长（CDS）1 374 nt，含有两个外显子和一个内含子，编码457个氨基酸，蛋白分子量为51.0 ku，等电点5.82，具有BTB/POZ、ANK 锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域。qRT-PCR 定量分析发现，HbNPR1基因在橡胶叶片中的表达丰度最高，特别是古铜期叶片；多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）诱导下HbNPR1基因在抗病品种（IAN873）的表达丰度明显高于感病品种（PR107）；另外，SA、MeJA、ET处理下均能诱导HbNPR1基因的表达，SA处理后的表达量丰度最高。本研究初步表明，HbNPR1基因可能参与橡胶树抗病信号途径的调控和寄主对病原菌侵染的防御反应。

关键词 橡胶树；HbNPR1基因；克隆；表达分析

中图分类号 S794.1；Q78 文献标识码 A

Cloning and Expression Analysis of Resistance-related

Gene HbNPR1 from Hevea brasiliensis

LI Boxun，SHI Tao，LIN Chunhua，LIU xianbao，CAI Jimiao，HUANG Guixiu*

1 Agronomy college， Hainan University， Haikou， Hainan 570228，Chiana

2 Environment and Plant Protection Institute， CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Tropical Crops， Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and

Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou， Hainan 571101，Chiana

Abstract A resistance related differential expression fragment of rubber tree to Corynespora leaf fall disease was obtained in pre-work， and named as EST-IAN-188. Blast showed that the fragment had high homology with NPR1， a plant resistance NPR gene family member. Based on the Hevea brasiliensis genome database， the long fragment including EST-IAN-188 was gained and Hevea NPR1 gene was cloned， named as HbNPR1. Sequence analysis revealed that the CDS length of HbNPR1 was 1 374 nt， encoding a protein of 457 amino acids with an average molecular weight of 51.0 ku， and a pI value of 5.82. Exon/intron structure analysis revealed 2 exons and 1 introns in HbNPR1 genomic sequence. The protein had four conserved domains of BTB/POZ， ANK anchored protein repeat sequences， DUF and NPR1-like C. The expression pattern of HbNPR1 in rubber plants was assessed by qRT-PCR. The tissue-specific expression analysis indicated that the HbNPR1 was mainly expressed in leaves， especially in the bronze blade. When C. cassiicola infected， the expression level of HbNPR1 was significantly higher in resistant rubber germplasm（IAN873） than in susceptible rubber germplasm（PR107）. The expressions of HbNPR1 were up-regulated by ethylene、salicylic acid and Methyl jasmonate treatment， especially by salicylic acid. The results preliminarily show that HbNPR1 gene may be involved in rubber tree resistance signal pathway.

Key words Hevea brasiliensis；Gene HbNPR1；Cloning；Expression Analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.007

植物抗病相关基因非表达子NPR1是植物抗病信号传导途径中起调控作用的关键基因。该基因不仅对植物系统获得抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR）起作用，而且是由抗病基因（R gene）决定抗性的重要调控因子，在植物防御反应中发挥着重要作用[1]。NPR1基因最早是Cao等[2]在模式植物拟南芥中克隆得到的，并证明该基因是SAR信号转导途径中作用于水杨酸（SA）信号途径下游的一个关键性调控因子，其W-box序列能与WRKY转录因子结合，激活NPR1来启动下游PR基因与病原菌直接作用，诱导植物系统获得性抗性（SAR）[2-3]。早期研究中，Ekengren等[4]沉默了NPR1及其互作的转录因子TGA1a和TGA2.2，发现番茄植株丧失了pto决定的对Pseudomonas syringaepv的抗性，表现出病害症状。随后Zhang等[5]又发现NPR1的时序表达与番茄抗病基因cf决定的过敏性坏死和抗性产生的时序性呈正相关，又进一步证明了NPR1在植物抗病基因R基因决定的抗性中的关键作用。在抗病信号传导途径中，水杨酸（SA）是诱发SAR产生的关键信号分子之一，茉莉酸（JA）和乙烯（ET）则为诱发ISR产生的关键信号分子，而NPR1既是水杨酸，又是茉莉酸和乙烯介导的抗病信号传导途径中起重要调控作用的基因，协调和平衡各信号途径的传导[6]。此外，在水稻、烟草、番茄等植物中都分离并克隆到与NPR1同源的基因，这些基因在介导植物抗病信号传导途径中都发挥着重要作用，而橡胶树中的NPR1基因是否也具有相似的功能，还有待进一步研究。

橡胶树棒孢霉落叶病（Corynespora leaf fall disease，CLFD）是近20多年来影响国际橡胶产业发展最为严重的叶部病害之一，主要造成橡胶叶片的大量脱落，植株长势降低甚至枯死，在亚洲，约有94%的橡胶产地都有该病为害，严重发生时可以导致干胶产量损失达20%～25%[7]，目前尚无十分有效的防治方法来控制该病害的发生。笔者前期利用cDNA-AFLP技术筛选到一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的基因片段EST-IAN-188，该基因片段与植物抗病相关NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性，目前有关NPR1基因在橡胶树中的作用机理和表达特性等研究国内外都未见报道。因此，本文对橡胶树NPR1基因进行克隆，通过qRT-PCR分析该基因的组织表达特性，分析病原菌诱导后在橡胶树抗病和感病种质中的表达差异，以及不同外源激素处理后的表达特性，为揭示NPR1基因在橡胶树中的作用机理以及橡胶树分子抗病机制提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和橡胶树品种 多主棒孢菌株HCCYN49由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离并保存。橡胶树品种IAN873和PR107定植于2010年，由中国热带农业科学院橡胶研究所提供。

1.1.2 培养基和试剂 HCCYN49菌株采用PDA培养基培养，配方参照《植病研究方法》[8]。TransZol Plant RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、Taq酶、dNTPs、DNA Maker、pMD18-T Vector Kit等生化试剂购自TaKaRa公司，引物由北京六合华大基因有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 植物材料处理 采用时涛[9]的方法制备浓度为1.0×106个孢子/mL的孢子悬浮液，参照Cai Zhiying[10]的方法喷雾接种到抗、感品种淡绿期的橡胶叶片上；配制浓度为0.2 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、0.5 mmol/L水杨酸（SA）、0.1%乙烯（ET）分别处理抗病品种（IAN873）和感病品种（PR107）淡绿期的橡胶叶片，均以灭菌水作为对照于接种后12、24、48和72 h的时间段取样。采集抗病品种（IAN873）不同组织（根、茎、淡绿期叶片）和不同物候期（古铜期、淡绿期、老叶期）橡胶叶片，迅速冻于液氮，后贮存于-80 ℃备用。

1.2.2 基因组DNA和总RNA提取 参照许玲[11]方法，对IAN873淡绿期叶片DNA进行提取。方法参照“TransZol Plant”说明书提取橡胶叶片和不同组织的总RNA，反转录cDNA合成参照“PrimeScriptR RT reagent Kit With gDNA Eraser”说明书进行。

1.2.3 cDNA全长及基因组序列的克隆 将差异片段序列在NCBI网站上利用Blastn程序进行同源性比对分析，同时与中国热带农业科学院橡胶研究所提供的橡胶树品种‘热研7-33-97基因组序列进行比对，获得包含该基因片段的大片段序列，将该序列在Softberry（http：//www.softberry.com）上进行目的基因的预测，获得NPR1基因的 cDNA和基因组序列，结合搜索得到的cDNA和基因全长序列设计特异性引物，全长cDNA扩增引物为HbNPR1 F1： 5′-ATCTGTGTATCTGTTGCTCT-3′、HbNPR1 R2： 5′-CCAATCATTCTCTCTTAGGA-3′基因组序列扩增引物为HbNPR1 F3： 5′-ATCTCCCTTTGGTCTC

CTCT- 3′、 HbNPR1 R4： 5′-GATTCTCTCTTACTA

ACCCT-3′。PCR反应体系为10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，Taq DNA poly-

erase（5 U/μL）0.3 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，模板（30 ng）1 μL， 加水补足至25 μL。反应条件为： 94 ℃预变性3 min， 94 ℃变性30 s， 58 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min， 35个循环， 72 ℃延伸10 min。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测获得目的片段经凝胶回收纯化试剂盒回收连接到pMD18-T载体上送公司测序。

1.2.4 生物信息学分析 利用DNAMAN软件分析目的基因编码的氨基酸序列，ProtParam软件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析其蛋白质大小、等电点等信息，ProSeale软件（http：//web. expasy.org/protscale/）软件分析蛋白质疏水性，InterProScan 软件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprs

can/）分析蛋白质的二级结构及保守域。同时，下载近源物种的同源基因氨基酸序列，用MEGA version5.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系统树，用Bootstrap对系统树进行检验，1 000次重复。

1.2.5 目的基因在橡胶树抗、感品种受多主棒孢侵染后的差异表达分析 基于目的基因序列设计荧光表达特异引物，采用实时荧光定量PCR来分析其表达特性。以组成型表达基因18s rRNA做为内参基因，设计引物18SS（5′-GCTCGAAGACGATCA

GATA CC-3′）和18SA（5′-TTCAGCCTTGCGACCA

TAC-3′）。按照Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡPerfect Real Time（Code： DRR081A）提供的说明书在ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System上进行荧光定量PCR分析。

2 结果与分析

2.1 EST-IAN-188差异片段序列比对及其基因预测

将EST-IAN-188差异片段序列与橡胶树全基因组数据库进行比对，结果与P99.08_scaffold2170的部分序列完全一致，选取其上下游各2.0 kb序列，将序列在Softberry数据库分别用橡胶树、烟草、拟南芥、番茄和苜蓿等模式进行基因预测，结果均表明该片段含有一个目的基因，该基因转录起始位点位于第103 nt处，polyA位点位于第2 655 nt处，有两个外显子。除拟南芥和番茄外，其余几种模式植物基因预测结果完全一致（如图1 a-c）。

2.2 目的基因的克隆及推导蛋白分析

本研究分别以IAN873和PR107两个橡胶树品种的cDNA和DNA作为模板 ，进行PCR和RT-PCR的扩增。结果显示：以cDNA为模板，在抗、感品种中均能扩增得到一条1.3 kb左右的目的条带；以DNA为模板抗、感品种中同样均能扩增得到一条2.6 kb左右的条带（图2），说明HbNPR1在橡胶树抗病和感病品种中都存在。经克隆、测序和序列分析发现，本研究得到一个橡胶树NPR1基因的cDNA和基因全长序列命名为HbNPR1，其cDNA序列已上传GenBank数据库获得登录号：KF753695。通过序列分析，推测该基因含有一个内含子和两个外显子，在启动子区有两个W-box序列（TTGAC）（图3），该序列是不同来源NPR1基因共有的核心启动元件。基因编码区全长1 374 nt，推测编码457个氨基酸，蛋白的分子质量为51.0 Ku，等电点为5.82。其氨基酸序列分别与蓖麻（XP_002514127.1）、三角杨树（XP_002308281.1）、可可（ADI24348.1）、葡萄（XP_002281475.1）等NPR1蛋白的氨基酸序列同源性较高，分别达到了89%、82%、79%和76%。用InterProScan工具对HbNPR1基因的蛋白质二级结构进行预测，并结合NCBI的结果对其保守结构域进行分析表明，该基因具有植物NPR1所共有的保守结构域，含有BTB/POZ结构域、ANK 锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域（图4）。通过氨基酸序列多重比对分析发现，橡胶树HbNPR1与蓖麻、可可、三角杨的NPR1氨基酸序列之间具有很高的相似性（图5）。

2.3 HbNPR1的系统进化树分析

为了明确所克隆的HbNPR1基因的系统进化情况，笔者根据Blast比对结果从公共数据库下载了与HbNPR1基因同源性较高的11种植物NPR1基因的氨基酸序列，与本研究HbNPR1基因的氨基酸序列一起建系统进化树，结果显示（图6），橡胶HbNPR1基因与蓖麻聚在一个分枝上，亲缘关系最近，这可能与它们同为大戟科的分类地位一致有关，另外橡胶与同为杨柳科的三角杨和大叶杨的亲缘关系也较近，都属于高大的乔木而被聚到了一个大的分枝上，而与茄科的辣椒和烟草，旋花科（甘薯），豆科（苜蓿）、葡萄科（葡萄）等的亲缘关系较远。

2.4 HbNPR1基因的组织表达特性分析

采用实时荧光定量PCR分析不同组织（根、茎、叶）和不同物候期橡胶叶片（古铜期、淡绿期、老叶期）HbNPR1基因的表达特性，结果表明（图7），HbNPR1基因在各组织和各物候期均能表达，但其表达量在不同部位差异显著；HbNPR1在叶片中的表达丰度最高，其次是茎，根部的表达量最低；另外HbNPR1基因在古铜期叶片中呈高丰度表达，淡绿期和老叶期的表达丰度相对较低。该基因在古铜期叶片的表达量最高，推测与其参与橡胶树系统获得性抗性（SAR）的作用有关。

2.5 多主棒孢病菌和不同外源激素诱导对HbNPR1基因表达的影响

目前已知的抗病信号传导途径主要包括水杨酸（SA），乙烯（ET）和茉莉酸（JA）介导的途径，它们参与不同类型抗性的调控[12]。如SAR主要通过水杨酸介导的途径，而ISR则通过乙烯和茉莉酸介导的途径来激活产生。用qRT-PCR分析橡胶叶片受多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）和不同外源激素（茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯）诱导下HbNPR1基因的表达特性，结果表明（图8），在0.5 mmol/L水杨酸、0.2 mmmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）和0.1%乙烯处理下HbNPR1基因均能上调表达，推测该基因在橡胶树3个信号途径中都能起调控作用，但水杨酸处理后的表达量比茉莉酸甲酯和乙烯处理后的表达量高，且不同时间处理下的表达量差异显著，说明该基因在橡胶树中主要参与水杨酸信号途径的转导。HbNPR1基因在水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯处理后24 h表达量达到最高，之后除茉莉酸甲酯外，水杨酸和乙烯处理48 h和72 h后的表达量都显著下降，但仍显著高于未处理的表达量，说明外源激素的处理能诱导HbNPR1基因的表达，且处理不同时间表达量差异显著。多主棒孢病菌接种抗病和感病橡胶叶片后发现，HbNPR1基因在抗病（IAN873）和感病（PR107）橡胶叶片中都能被该病菌诱导表达，但抗病品种中的表达量明显高于感病品种，从未接种病原菌前抗病品种的表达量就显著高于感病品种，接种12 h后感病品种的表达量略高于抗病品种，24 h后两个品种的表达量都达到最高值，且抗病品种显著高于感病品种，之后抗病品种的表达量都高于感病品种，进一步推测病原菌诱导能促进HbNPR1基因表达量的升高，但在抗病和感病橡胶品种中的表达模式不同。

3 讨论与结论

项目组前期研究中获得了一个与NPR家族蛋白具有高度同源性的EST特异性表达序列（EST-IAN-188），本研究将该序列与橡胶树全基因组数据库进行本地Blast比对，从橡胶树中克隆得到一个NPR1基因，将其命名为HbNPR1。序列分析发现，该基因在氨基酸序列与蓖麻、三角杨树、可可的NPR1具有很高的同源性，在进化上与蓖麻的亲缘关系最近；氨基酸序列分析表明，橡胶树HbNPR1基因含有植物NPR1蛋白所共有的保守结构域，其中ANK结构域是NPR1基因与TGA转录因子结合的必要元件，正向调控PR基因的表达，使植物产生SAR；NPR1-like C结构域含有两个保守序列LENRV和DLN，该结构在抗病信号传递途径中起重要的调节作用[13]；NPR1蛋白C-末端的核定位序列（NLS）能使NPR1单体在细胞核内积累，从而激活下游防卫基因表达；另外在橡胶HbNPR1基因的启动子区域含有2个W-box序列（TTGAC），拟南芥的AtNPR1基因有3个[14]，荆州黑麦ScNPR1基因有4个[11]，Yu等[15]研究证明W-box序列能与转录因子WAKY相结合，正向调控NPR1表达，从而激活下游因子，增强PR基因的表达，使植物产生抗性。

NPR1的组织特异性表达研究发现，拟南芥AtNPR1基因、水稻OsNPR1基因均无组织特异性表达[16]，而荆州黑麦ScNPR1基因在根、茎、叶、穗、节中均有表达，在叶和茎表达量较高，具有一定的组织表达差异；本研究中HbNPR1基因在根、茎、叶中也均有表达，且表达丰度存在明显差异，在叶片中的表达丰度最高，其次是茎，根的表达丰度最低；在不同物候期橡胶叶片中，古铜期的表达丰度最高。该基因在橡胶树不同组织和不同物候期叶片的表达差异是否与其参与调控抵御病原菌的作用有关还有待进一步的证实。

NPR1作为多种信号途径的交叉点，与WRKY转录因子结合，在调节和平衡水杨酸和茉莉酸等信号传导途径中起关键作用。Spoel等[17]发现，接种PstDC3000后，NahG转基因植株不能积累水杨酸，但其茉莉酸含量增加25倍，同时茉莉酸信号传导基因的表达也显著增强，而npr1突变株中，这种抑制作用显著减弱，表明NPR1在水杨酸信号传导途径抑制茉莉酸信号传导途径中的关键作用。Alvarez等发现用水杨酸处理或病原菌侵染可以使拟南芥AtNPR1的表达量比未处理前增加2～3倍，水杨酸的积累可激活NPR1与TGA转录因子相互作用，引起下游抗病基因的表达[16]。本研究发现橡胶HbNPR1基因在水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯诱导下表达量都升高，且不同时间段其表达差异显著，但水杨酸处理下的表达量明显的高于茉莉酸甲酯和乙烯，在处理24 h表达丰度达到最高值，推测该基因在橡胶树的3个信号途径中都能起到调控的作用，但所起的作用可能各不相同。然而HbNPR1基因在橡胶树体内是如何平衡和调节不同信号途径诱发的防卫反应以及这些信号途径是如何互相协调发挥作用的还有待进一步的研究。另外，本研究发现，橡胶树抗病（IAN873）和感病（PR107）种质受多主棒孢病菌侵染后HbNPR1基因的表达存在明显差异，抗病品种的表达丰度高于感病品种，且不同的时间段抗病品种的表达量都略高于感病品种，这是否能说明HbNPR1基因在不同抗性水平的橡胶种质中的表达模式也存在一定的差异？这些结果有助于进一步明确HbNPR1基因在橡胶树抗病途径中的作用机制。

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责任编辑：凌青根