钟云芳等

摘 要 运用ISSR分子标记技术，分析海南岛石灰岩地区海南凤仙花自然种群的遗传结构，比较3个海拔梯度对种群遗传结构的影响。结果显示，13个ISSR引物的扩增结果显示其多态性位点百分率为97.7%。AMOVA分析表明：海南凤仙花自然种群的变异主要来自种群内（92%），而种群间变异较少（8%）；中海拔种群的遗传多样性最为丰富；而高海拔种群的遗传多样性则较低；种群的遗传距离和地理距离表现出显著的高度相关性。说明海拔是影响种群基因流的重要因素，高海拔种群可以向中低海拔种群进行传播花粉和种子等基因流动，而中低海拔种群向高海拔种群进行类似的基因流动则较为困难，海南凤仙花数量较少的主要原因可能来自于其生境的限制。因此在以后的保护工作中要特别注重其生境的保护，避免人为因素的破坏。

关键词 海南凤仙花；遗传标记；海拔梯度；濒危机制

中图分类号 Q948.12.2 文献标识码 A

ISSR Analysis on Population Genetic Diversity of Impatiens hainanensis Balsaminaceae， an Endemic

Species to Hainan Island

ZHONG Yunfang1，3， HU Xiangyu1，2， SONG Xiqiang1，2， ZHOU Zhaode1，3 *

1 Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），

Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Impatiens hainanensis is endemic to Hainan Island. Its number of plants is very low and habitat is easily damaged. This research used the ISSR molecular marker technology to analysis the genetic diversity of Impatiens hainanensis population and compared the effects of three elevation gradients on population genetic structure. The results indicated that： 13 ISSR primers amplification results showed that the polymorphism loci percentage is 97.7%； AMOVA analysis indicated that the variation of Impatiens hainanensis population occurred mainly within populations（92%）and limitedly between populations（8%）； Altitude populations in the most abundant genetic diversity； The high altitude population genetic diversity is low； genetic distance and geographic distance of population showed a significantly high specificity. Analysis shows that altitude is the important factors that affect the population gene flow， high altitude populations can be spread pollen and seeds to the low altitude populations， the similar activity from low altitude populations to high altitude populations is more difficult， the main reason for the small number of Impatiens hainanensis plants came from its habitat. So in the future for protection work， we should put special emphasis on the habitat protection and avoid the destruction of the human factors.

Key words Impatiens hainanensis； Genetic markers； Altitude gradient； Endangered mechanism

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.001

遗传多样性是生物多样性的核心，保护生物多样性最终是要保护遗传多样性[1]。通常，遗传多样性最直接的表现形式就是遗传变异水平的高低。对任何一个物种来说，个体的生命很短暂，由个体构成的且在时间上连续不断的种群或种群系统（宗、亚种、种），才是进化的基本单位[2-3]。对于种群内或者种群间以及种内或者种间遗传多样性的鉴定和评估，分子标记已经被证明是一种较好的方法[4]，不同变异的级别需要不同的分子标记方法[5-6]。ISSR （Inter-Simple Sequence Repeat）分子标记，又称简单重复序列区间，其原理是利用真核生物基因组内广泛存在的简单重复序列，设计单一通用引物对基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经较高浓度的琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳分离获得扩增指纹图，从而可以揭示样本间的遗传多样性[7-8]。ISSR技术克服了RAPD（random amplified polymorphic DNA）的低再现性、AFLP（amplified fragment length polymorphism）的高耗费以及SSR（Simple Sequence Repeat）必须知道两侧基因序列等因素的限制[9]。此外其高度多态性以及快速性等特点[10-12]无疑为其在高等植物研究中提供了广阔的应用前景[10]。近年来，ISSR分子标记技术广泛应用于包括遗传多样性、系统发生学以及进化生物学等研究[13]。何俊等[14]通过ISSR技术对多叶重楼3个变种共8个居群进行了遗传多样性分析，结果表明，各个居群的遗传多样性较高，滇重楼与狭叶重楼有较近的亲缘关系；曹国艳[15]使用ISSR分子标记进行木兰科含笑属及其相关属的系统发育分析，结果显示，木莲属和木兰属的皱种组与天女木兰组亲缘关系较近，建议重新界定木兰属范围，并成立玉兰属，建议将合果木属归入含笑属，建议取消含笑属下亚属和组的划分，设为含笑属；龚汉雨等[16]使用31个ISSR引物对山羊草属Aegilops多倍体植物及其祖先二倍体的基因组进行了分析，结果表明，与其二倍体祖先种相比，异源多倍体物种的基因组发生了很大变化。

海南凤仙花（Impatiens hainanensis Y. L. Chen）是海南特有植物，主要分布在海南昌江县、东方市等地区的石灰岩山顶，多见于裸露石灰岩缝隙[17]。近年来由于人类活动的影响，海南凤仙花的种群数量和分布面积呈减少趋势，再加上岛屿特有种本身分布范围的局限、生境脆弱且种群数量较少，更易于濒危或灭绝[18-19]，海南凤仙花已被列为海南省级重点保护植物[20]。本研究采用ISSR分子标记技术，研究海南凤仙花的种群遗传多样性水平以及数量稀缺的主要原因，海拔高度以及地理距离对于海南凤仙花种群遗传多样性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料采集与处理

研究区域为海南省昌江黎族自治县王下乡和东方市江边乡峨贤岭地区（图1所示为海南凤仙花种群区位），记录海南凤仙花自然种群分布的经纬度、海拔和生境（表1）。实验材料为海南凤仙花（I. hainanensis）叶片，每个种群采集14～30个植株，平均采样，以每个植株的2～3个叶片为一个样本，采集后立即放入盛有干燥硅胶的封口袋内，每隔3～5 h翻动硅胶，确保24 h内干燥完全。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取及纯度检测 采集后的叶片用液氮研磨，并用CTAB法进行提取，琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，电压120 V电泳30 min。紫外分光光度计法计算所得DNA的浓度和纯度。

1.2.2 ISSR-PCR扩增体系 采用20 μL扩增体系：DNA 25 ng，Taq酶1 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Primer 1.0 μmol/L。扩增程序：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物使用1.6%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 ISSR-PCR引物筛选 以加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的100套引物进行筛选（Http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf）。每个种群选择3个模板，筛选出13条扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物（表2）。

1.3 数据的统计与分析

13条引物对各个居群进行扩增之后，采用人工读带，根据条带的迁移率和有无记录二元数据，有带记为1，无带记为0。排除模糊不清的带和无法准确标识的带。用POPGENE 1.32软件计算种群遗传多样性和遗传分化等指数，并用UPGMA进行聚类分析。应用GenAlEx 6.41（Genetic Analysis in Excel）软件对种群内和种群间的遗传变异进行分子变异分析（AMOVA）。

2 结果与分析

2.1 种群遗传多样性分析

13条引物对来自不同地点的种群共计182个样本DNA进行扩增，共扩增出87个位点，其中多态性位点85个（表2），多态性位点百分率（P）为97.7%。

高海拔种群的Neis基因多样性（He）数值在0.291 0～0.378 1之间，平均值为0.323 5，而中低海拔的种群的Neis基因多样性（He）数值在0.388 5～0.395 8之间，平均值为0.391 3，最大值与最小值分别出现在Pop4（0.395 8）和Pop2（0.291 0）（表3），高海拔种群和低海拔种群的Neis基因多样性（He）差异显著。

与Neis基因多样性（He）相似，高海拔种群的Shannon信息指数（Ho）数值在0.439 0～0.558 4之间，平均值为0.489 4，而中低海拔种群的Shannon信息指数（Ho）数值在0.571 4～0.578 4之间，平均值为0.573 1，最大值和最小值同样出现在Pop4（0.578 4）和Pop1（0.439 0）（表3），高海拔种群和低海拔种群的Shannon信息指数（Ho）差异显著。

2.2 种群遗传结构

2.2.1 种群遗传分化 遗传变异主要发生在种群内部。种群总基因多样度（Ht）为0.422 2，其中种群内的基因多样度（Hs）为0.366 8；种群间的遗传分化系数（Gst）为0.131 1，即86.9%遗传分化发生在种群内部；而13.1%的遗传分化发生在种群间，表明种群间具有一定水平的遗传分化，大部分的遗传变异主要发生在种群内部（表4）。AMOVA分析表明，种群内部和种群间均存在显著的遗传分化（P=0.010），种群间遗传变异占总遗传变异的8%，种群内占92%（表5）。上述结果与POPGENE分析基本一致。

2.2.2 基于遗传一致度的聚类分析 根据Nei的方法，计算Nei遗传距离及遗传一致度。采样区域的海南凤仙花自然种群之间的遗传距离变化范围为0.004 6～0.221 7之间（表6），平均遗传距离为0.122 1。从UPGMA聚类法得到的遗传关系图（图2）可看出，pop1种群和pop2种群聚类在一起，pop6种群和pop7种群聚类在一起；pop3种群遗传关系与其他6个种群遗传距离最远。

2.2.3 遗传距离与地理距离的相关性分析 根据种群经纬度在谷歌地球中测量2个种群之间的位置（表7），海南凤仙花自然种群之间的遗传距离和地理距离呈现显著的高度相关性，相关系数r=0.952（p<0.01），暗示着地理距离可能是限制海南凤仙花自然种群间基因流动的重要因素。

3 讨论与结论

3.1 海南凤仙花的遗传多样性

海南凤仙花种群的多态性位点百分率高达97.7%，远远超过双子叶植物平均值44.8%，由此可知，海南凤仙花种群具有较高的遗传多样性水平[21]。海南凤仙花自然种群中低海拔的遗传多样性远远高于高海拔梯度的种群（表3），这一结果与北京东灵山柴胡在中低海拔种群的遗传变异高于高海拔种群一致，可能是由于随着海拔升高，光照、温度和水分等环境因素变化所致[22]。这种有限地理范围内的种群变异主要来自于生境选择压力[23-24]。海南凤仙花高海拔种群生境较为单一，环境趋于极端，相应的其群落组成也较为单一；而中低海拔种群的生境异质性高，其植物群落组成较复杂，选择压力大，因此也就表现出较高的变异。不同海拔种群变异不同的原因一方面可能是环境因子的变化导致，另一方面可能是因为低海拔地区向高海拔地区的基因流动较为困难，其基因流限制在相似海拔高度的种群，而高海拔地区向低海拔地区的基因流则较为容易[25]。

3.2 海南凤仙花的遗传结构

种群间分化与环境因子的选择和基因流的阻隔有关，生态小环境的变异可导致不同种群间在遗传结构上的显著差异[26]。种群间变异越大，该物种适应环境的能力越强[27]。海南凤仙花种群的变异主要来自种群内（92%），而种群间变异较小（8%），说明海南凤仙花种群的环境适应性较低。种群遗传距离和地理距离之间的关系现在还没有比较确切的定论。种群遗传距离和地理距离在一些研究中表现为显著的正相关关系[28-31]，但也有研究得到了相反的结论[32-34]。本研究结果表明，海南凤仙花自然种群的遗传距离和地理距离具有高度的相关性，这可能是因为花粉和种子的传播受到了昆虫飞行距离和种群生境片段化影响所致。海南凤仙花种群海拔较高，种群之间由于地形的限制，从而出现了生境的片段化，而生境片段化的另一结果则是对昆虫传粉距离的限制，因此海南凤仙花种群的地理距离可以在某一程度上反应其种群的遗传距离。

3.3 海南凤仙花濒危机制及其资源保护

海南凤仙花种群生境较为单一，种群间的变异较小，说明海南凤仙花自然种群之间的基因流动较少。因此限制海南凤仙花种群发展的重要原因来自于地形因素和其自身生境，具体表现为种群生境的片段化以及生境结构的单一性。针对海南凤仙花种群植株较少这一现象，一方面要着重保护其栖息地和生境免受人为因素的破坏，进行就地保护，更好地保护其群体的遗传特性。另一方面还可结合迁地保护和再引入，通过种群间人工授粉的方法提高其基因流，以促进其种群的发展。

致 谢 海南省霸王岭国家自然保护区王进强助理工程师、海南大学园艺园林学院张哲和武华周同学参与了部分野外调查工作，特致谢忱！

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责任编辑：赵军明