李芳

摘要：提取在北京市房山地区野外环境中采集的1株野生菌子实体的基因组DNA，并以此为模板进行ITS、LSU和SSU片段的扩增、测序及比对分析。结果发现，从菌丝体基因组DNA中扩增获得了700 bp左右的ITS片段、850 bp左右的LSU片段和1 800 bp左右的SSU片段，经序列测定及比对，表明该真菌是Marasmiellus属菌株。建立了一种野生真菌快速、准确的鉴定方法。

关键词：皮伞属；分子鉴定；ITS；LSU；SSU

中图分类号： S646.01 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0024-02

我国地域广阔，野生食用菌资源丰富、种类繁多、分布广泛、蕴藏量大。野生食用菌分类鉴定是涉及资源保护利用及产业发展的一项基础性研究工作[1]。随着分子生物学技术的广泛应用，从分子的层面上对野生菌进行快速、有效的鉴定，为野生菌的鉴定、开发及利用提供了很大的便利[2]。本研究对北京市房山地区采集的1株野生菌进行分子鉴定，并通过多个核基因序列的测定及比对分析，从而对该野生菌株的遗传地位进行解析，为该野生菌的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 子实体，采集自北京市房山区东湖港风景区的野生菌。

1.1.2 试剂 基因组DNA提取试剂盒Dneasy Plant Mini Kit和凝胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit购自德国QIAgen公司；TaKaRa PCR Mix购自大连宝生物公司；琼脂糖购自Invitrogen公司。

1.1.3 仪器 PCR仪（BIO-RAD，mycycler）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、电泳仪（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、离心机（Eppendorf 5418）、移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 取少量子实体于1.5 mL离心管中，加入少量液氮，研磨棒研磨至粉末状后，利用Dneasy Plant mini Kit试剂盒（QIAgen，货号：69104）说明书进行DNA的提取。

1.2.2 ITS-PCR扩增 选取ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为引物[3]，以所提基因组DNA为模板进行PCR 扩增。扩增程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 7 min；降至4 ℃结束。反应体系为50 μL。然后进行电泳检测。

1.2.3 LSU-PCR扩增

选取LR5（5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）和LROR（5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）为引物，以所提基因组DNA为模板进行PCR 扩增。扩增程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min；降至4 ℃结束。反应体系为 50 μL。然后进行电泳检测。

1.2.4 SSU-PCR扩增

选取NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）和NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）为引物，以所提基因组DNA为模板进行PCR 扩增：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min；降至4 ℃结束。反应体系为50 μL。然后进行电泳检测。

1.2.4 PCR产物测序及分析

PCR产物经过切胶回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司利用PCR扩增引物为测序引物进行测序。测序结果经过DNAMAN5.2.9和Chromas Pro软件进行碱基修正与拼接，最终获得的ITS、LSU和SSU序列提交到GenBank 核酸序列数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），并与数据库中已知的相关序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

以所获得的基因组DNA为模板，以材料与方法中所列的引物进行PCR扩增，结果如图1所示，所得ITS产物片段大小为700 bp左右，LSU产物片段大小为850 bp左右，SSU产物片段大小为1 800 bp左右，与预期结果相一致。

2.2 序列测定及提交

上述3个PCR产物进行凝胶电泳，电泳条带经过QIAquick Gel Extraction Kit回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。测序结果经过Chromas Pro软件进行碱基修正，修正后的正向引物的测序结果和反向引物的测序结果经过DNAMAN5.2.9软件进行拼接，最终获得ITS序列 634 bp，LSU序列834 bp和SSU序列1 758 bp。将上述序列提交至GenBank，获得GenBank登录号分别为：KJ545432、KJ545433和KJ545434。

2.3 BLASTN比对分析

在NCBI网站上用BLASTN程序进行比对。ITS序列（GenBank登录号KJ545432）的比对结果显示，该序列与Uncultured root-associated fungus clone SC0IIc23P（FJ362110）、Uncultured Agaricales clone J2c863H（GQ924015）和Crinipellis aff. iopus JFK-2009a isolate n774（FJ167636）的相似性系数为100%，与Marasmiellus palmivorus isolate C1（JQ653443）的相似性系数为97%；LSU序列（GenBank登录号KJ545433）的比对结果显示，该序列与Marasmiellus palmivorus isolate C6（JQ654236）和Marasmius ruforotula voucher BRMN 714674（FJ917612）的相似性系数为100%，与Moniliophthora sp. UTC 253824（JN692483）的相似性系数为98%；而SSU序列（GenBank登录号KJ545434）的比对结果显示，该序列与Moniliophthora sp. MCA2500（AY916753）和Marasmius sp. MCA1708（AY916719）相似性系数为100%，与Crinipellis zonata strain OKM 25450（AY916691）的相似性系数为99%。由于SSU比对分析结果中发现目前还没有Marasmiellus sp.序列提交，导致比对结果中没有Marasmiellus sp.菌株的SSU序列信息。

因此综合以上比对结果，将本研究所用的菌株鉴定为Marasmiellus sp.菌株。

3 讨论

由于ITS序列比5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA更容易突变累计，被认为是在物种或物种内水平最有用的累计突变区域[4]。ITS目前已经被认为是真菌分子鉴定的条形码[5]。但是相关研究表明，ITS对于种内的区分不是很理想，因此，有必要结合其他的序列作为辅助的条形码，对物种进行鉴定[6]。

核糖体小亚基（small subunit，SSU）序列rRNA 基因是编码rRNA 的基因，是高度重复串联序列。 因此，核糖体小亚基rRNA 基因的测序与分析在物种鉴定与系统发育演化方面的应用越来越广泛[7]。然而SSU序列较长，一般为 1 800 bp 左右，扩增所用时间较长，测序则需要3个反应才能测通获得全长序列。

LSU核糖体大亚基（large subunit，LSU）基因组的序列是位于25～28S的RNA序列。大多数分子系统学研究中都选择部分片段进行分析，相对比较保守[8]。本研究只采用LSU序列5′端900 bp的片段，获得了较好的鉴定结果，因此根据本研究的结果，皮伞属较为适合的条形码为ITS+LSU。

参考文献：

[1]许 峰，刘 宇，王守现，等. 一株野生大型真菌的分离与鉴定[J]. 中国农学通报，2012，28（13）：176-179.

[2]尹永刚，刘 宇，许 峰，等. 一株Agaricus属野生菌的分离与鉴定[J]. 华北农学报，2012，27（3）：126-129.

[3]White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR protocols： a guide to methods and applications. New York： Academic Press，1990.

[4]Wang P，Liu Y，Yin Y G，et al. Diversity of microorganisms isolated from the soil sample surround Chroogomphus rutilus in the Beijing region[J]. International Journal of Biological Sciences，2011，7（2）： 209-220.

[5]Schoch C L，Seifert K A，Huhndorf S，et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer （ITS） region as a Universal DNA barcode marker for fungi[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（16）： 6241-6246.

[6]李艳春，吴 刚，杨祝良. 我国云南食用牛肝菌的DNA条形码研究[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（6）：725-732.

[7]Hansen Karen，Lobuglio K F，Pfister D H. Evolutionary relationships of the cup-fungus genus Peziza and Pezizaceae inferred from multiple nuclear genes： RPB2，beta-tubulin，and LSU rDNA[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2005，36（1）： 1-23.

[8]Pfister D H，Slater C，Hansen K. Chorioactidaceae： a new family in the Pezizales （Ascomycota） with four genera[J]. Mycological Research，2008，112（5）： 513-527.